Struktureller Einblick in den intraflagellaren Transportkomplex IFT

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1506 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Intraflagelläre Transportzüge (IFT), die Polymere, die aus zwei Komplexen mit mehreren Untereinheiten, IFT-A und IFT-B, bestehen, führen einen bidirektionalen intrazellulären Transport in Zilien durch, der für die Zilienbiogenese und Signalübertragung von entscheidender Bedeutung ist. IFT-A spielt eine entscheidende Rolle beim Zilienimport von Membranproteinen und beim retrograden Frachttransport. Die molekulare Architektur von IFT-A und der Mechanismus des Zusammenbaus von IFT-A in die IFT-Züge in vivo sind jedoch noch unklar. Hier berichten wir über die kryoelektronenmikroskopischen Strukturen des IFT-A-Komplexes des Protozoen Tetrahymena thermophila. Wir stellen fest, dass IFT-A-Komplexe zwei unterschiedliche, verlängerte und gefaltete Zustände aufweisen. Bemerkenswert ist, dass ein Vergleich mit der In-situ-Kryo-Elektronentomographie-Struktur des anterograden IFT-Zugs eine Reihe von Anpassungen der flexiblen Arme im Apo IFT-A enthüllt, wenn sie in den anterograden Zug integriert werden. Unsere Ergebnisse liefern ein Modell mit atomarer Auflösung für den IFT-A-Komplex und wertvolle Einblicke in den Aufbaumechanismus anterograder IFT-Züge.

Zilien sind hochkonservierte Organellen, die aus der Zelloberfläche herausragen und eine Vielzahl von Aufgaben erfüllen1. Eine Funktionsstörung der Zilien führt zu zahlreichen Krankheiten beim Menschen, den sogenannten Ziliopathien, die mit Sehstörungen, Nierenfunktionsstörungen und männlicher Unfruchtbarkeit einhergehen2. Die intraflagellare Transportmaschinerie (IFT) ist für den Aufbau und die Aufrechterhaltung der Zilien sowie für die Signalübertragung durch die Lieferung von Ladungen in und aus den Zilien von wesentlicher Bedeutung3,4.

Jeder IFT-Zug ist ein Polymer aus zwei großen Komplexen IFT-A und IFT-B mit einem Molekulargewicht von ~0,8 MDa bzw. 1 MDa5. Der IFT-B-Komplex besteht aus einem Kernunterkomplex IFT-B1 mit 10 Untereinheiten und einem peripheren Unterkomplex IFT-B2 mit 6 Untereinheiten und vermittelt den anterograden Transport (zur Spitze hin) von Ziliarproteinen, der durch den Mikrotubuli-Motor Kinesin-26,7 gesteuert wird. 8. Der IFT-A-Komplex besteht aus sechs Untereinheiten (IFT144, IFT140, IFT122, IFT121, IFT139 und IFT43), die sowohl den durch Dynein-1b gesteuerten retrograden Transport (zur Basis) als auch den Zilienimport verschiedener Membranproteine über das Protein hinweg vermitteln Ziliarpforte9,10,11,12,13,14. Die In-situ-Kryoelektronentomographie (Kryo-ET)-Untersuchung des anterograden Zuges bei Chlamydomonas reinhardtii zeigt, dass der anterograde Zug dicht gepackt ist, wobei IFT-B als Rückgrat zwischen IFT-A und dem Axonem liegt und IFT-A direkt lokalisiert ist unterhalb der Ziliarmembran15. Nach Erreichen der Ziliarspitze werden die anterograden Züge in vollständig unterschiedliche zickzackförmige retrograde Züge umgestaltet, die mehrere Ereignisse koordinieren, darunter die Inaktivierung von Kinesin-2, die Aktivierung von Dynein-1b und die Freisetzung von Ladungen15,16,17,18,19,20. Defekte oder verringerte Konzentration von IFT-A führen zu kurzen Zilien mit verringerten Geschwindigkeiten des retrograden Transports und der Ansammlung von IFT-B an der Ziliarspitze21,22,23,24,25. Mutationen in IFT-A-Genen verursachten eine Vielzahl von Ziliopathien, darunter Skelett-, Nieren- und Augenerkrankungen2,26. Das Fehlen hochauflösender IFT-A-Strukturen behindert unser Verständnis des Montagemechanismus von IFT-A in die IFT-Züge und der molekularen Grundlagen des Zilienhandels und der Ziliopathien erheblich.

Kürzlich berichteten mehrere Studien über hochauflösende Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) IFT-A-Strukturen sowie ein 20,7-Å-In-situ-Kryo-ET-Modell des anterograden IFT-Zugs27,28,29,30. Hier haben wir den IFT-A-Komplex aus Protozoen Tetrahymena thermophila gereinigt und die Kryo-EM-Strukturen des IFT-A-Komplexes und seiner Unterbaugruppen mit einem Auflösungsbereich von 3,6 bis 8,8 Å bestimmt. Die Analyse dieser Strukturen zeigt, dass der Apo-IFT-A-Komplex aus zwei starren Strukturmodulen besteht, dem Kopf- und dem Basismodul, und in Lösungen zwei unterschiedliche, verlängerte und gefaltete Zustände aufweist, wobei letzterer im aktuellen IFT-A nicht identifiziert wurde Strukturstudien27,28,29,30,31. Darüber hinaus stellen wir fest, dass IFT-A über eine Reihe von Anpassungen der flexiblen Arme im Apo-IFT-A in den anterograden IFT-Zug integriert ist. Zusammengenommen erweitern unsere Ergebnisse unser Verständnis des Aufbaumechanismus von IFT-Zügen erheblich und liefern strukturelle Einblicke in die Pathogenese krankheitsbedingter IFT-A-Varianten beim Menschen.

Um den Aufbaumechanismus des IFT-A-Komplexes zu verstehen, haben wir einen carboxylterminal mit Flag und Protein-A markierten IFT122-FZZ-Stamm von Tetrahymena thermophila erzeugt. Zur Anreicherung des endogenen Tetrahymena-IFT-A-Komplexes wurde ein zweistufiges Affinitätsreinigungsschema eingesetzt. Der gereinigte Komplex wurde dann einer SDS-PAGE- und Massenspektrometrieanalyse unterzogen, wodurch das Vorhandensein aller sechs Komponenten von IFT-A bestätigt wurde (Abb. 1a, b, ergänzende Abb. 1a und ergänzende Daten 1). Bemerkenswerterweise enthüllte das native PAGE-Bild zwei separate verschmierte Banden von IFT-A, was darauf hindeutet, dass dieser hochreine Komplex zwei Hauptkonformationen annimmt, einen heterogenen, langsam wandernden Zustand und einen homogeneren, schnell wandernden Zustand (Abb. 1b). Die zweidimensionale Klassifizierung negativer Färbungsdaten ergab, dass Apo-IFT-A-Partikel äußerst flexibel sind und entweder längliche oder gefaltete Konformationen annehmen, entsprechend den langsam und schnell wandernden Zuständen, die durch die native PAGE-Analyse erfasst wurden (Abb. 1b – d). ).

a Domänenorganisationen der IFT-A-Komponenten. IFT144, IFT140, IFT122N, IFT122C, IFT121, IFT139 und IFT43 haben die Farben Goldrute, Lachs, Grün, Grüngelb, Türkis, Blau und Violett. Schwarze Sternchen kennzeichnen die Helices, die zwischen der zweiten und dritten TPR-Wiederholung in IFT144, IFT140, IFT122 und IFT121 eingefügt werden. Die Komponenten des Kopf- und Basismoduls haben eine hellgelbe bzw. hellblaue Hintergrundfarbe. Modelle von IFT144WD1, IFT144C, IFT140C und IFT139N, die mit Hilfe von AlphaFold-2 gebaut wurden, sind in gestrichelten Ovalen oder Kreisen dargestellt. Die mittlere ungeordnete Schleife von IFT43 ist in einer gestrichelten Linie dargestellt. b Silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel (links) und natives PAGE-Gel (rechts) zeigen die Reinheit und die Hauptkonformationen des gereinigten IFT-A-Komplexes. Jedes Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. c Ein repräsentatives negatives Färbebild des IFT-A-Komplexes. Zwei unterschiedliche Konformationen der Partikel sind durch ein rotes Rechteck bzw. einen roten Kreis gekennzeichnet. d 2D-Klassenmittelwerte der negativen Färbebilder des IFT-A-Komplexes. Kryo-EM-Dichtekarten des länglichen (e) und gefalteten (f) IFT-A-Komplexes in zwei orthogonalen Ansichten. Die Kopf- und Basismodule sind in Hellgelb bzw. Hellblau gehalten. g Ein schematisches Diagramm, das die Konformationsänderung des Kopfmoduls vom länglichen in den gefalteten Zustand zeigt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Kryo-EM-Struktur von Tetrahymena IFT-A zu bestimmen, haben wir 66.729 rohe IFT-A-Partikelbilder in verglastem Eis gesammelt (ergänzende Abbildung 1b). Durch die Unterklassifizierung konnten wir zwei unterschiedliche Partikelklassen erhalten, die die Dichtekarten für den länglichen und gefalteten IFT-A-Komplex mit Auflösungen von 8,5 Å bzw. 8,8 Å ergaben (Abb. 1e, f und ergänzende Abb. 2,3). . Eine vergleichende Analyse dieser beiden Karten ergab, dass IFT-A aus zwei starren Modulen mit ähnlichen Größen besteht, die wir im Folgenden als Kopf- und Basismodule von IFT-A bezeichnen (Abb. 1e, f). In dem länglichen Komplex grenzen Kopf- und Basismodul aneinander und bilden eine schlanke „S“-förmige Architektur, die sich in der längsten Dimension über mehr als 370 Å erstreckt (Abb. 1e). Im krassen Gegensatz dazu dreht sich in der gefalteten Konformation das Kopfmodul als starrer Körper um etwa 125° aus seiner Position im gestreckten Zustand, um sich zurück auf das Basismodul zu falten, was die dynamische Natur des Apo-IFT-A-Komplexes veranschaulicht (Abb. 1e– G).

Um die Struktur des IFT-A-Komplexes auf atomarer Ebene aufzudecken, verwendeten wir eine lokal fokussierte Klassifizierung, um die EM-Dichtekarten der Basis- und Kopfmodule individuell zu verbessern, was es uns ermöglichte, die Modelle beider Module durch De-novo-Tracing mit zu erstellen Hilfe der AlphaFold-2-Vorhersage (Ergänzende Abbildungen 2–5 und Tabelle 1)32. Mit Ausnahme von IFT43 enthalten alle fünf großen Komponenten von IFT-A eine lange Reihe von Tetratricopeptid-Wiederholungen (TPRs), die das Gesamtgerüst des Komplexes bilden (Abb. 1a und ergänzende Abb. 6). Insbesondere IFT144, IFT140, IFT122 und IFT121 haben vom N- zum C-Terminus die gleiche Domänenorganisation und umfassen zwei Tandem-WD40-β-Propeller (WDs), eine Anordnung von 12 bis 20 TPRs und, mit Ausnahme von IFT140, eine Zinkbindungsdomäne (ZBD) (Abb. 1a). Diese vier Untereinheiten sind auf die beiden Module verteilt; Das Kopfmodul besteht aus IFT140, IFT144 und der C-terminalen Hälfte von IFT122 (IFT122C, 706-1246), während das Basismodul aus IFT121, dem N-Terminus von IFT122 (IFT122N, 1-705) sowie IFT139 und besteht IFT43 (Abb. 2a, b). Interessanterweise sind die N-terminalen WD40-Propeller zusammen mit den ersten vier TPRs von IFT140 und IFT144 im Kopfmodul durch eine pseudo-zweizählige Symmetrie organisiert, bei der es eine einzigartige α-helikale Insertion zwischen dem zweiten und dritten TPRs in IFT140 gibt und IFT144 ermöglicht es TPRs an der Verbindungsstelle, sich sowohl in Form als auch in elektrostatischer komplementärer Weise in einer Zick-Zack-Konfiguration zu verriegeln (Abb. 1a, 2c und ergänzende Abb. 7a). Eine ähnliche pseudo-zweifache symmetrische Konfiguration findet sich auch im IFT121-IFT122-Heterodimer im Basismodul, was die Erhaltung dieses grundlegenden Organisationsmechanismus in beiden Modulen von IFT-A unterstreicht (Abb. 1a, 2d und ergänzende Abb. 7b). In Übereinstimmung mit ihrer strukturellen Bedeutung verursachen einzelne Missense-Mutationen oder zusammengesetzte heterozygote Variationen in den ersten vier TPRs der menschlichen IFT121, IFT122, IFT140 und IFT144 mehrere Ziliopathien, einschließlich kranioektodermaler Dysplasie, angeborener Leberamaurose und Kurzrippen-Thoraxdysplasie33,34,35, 36.

Atomare Strukturen der Kopf- (a) und Basismodule (b). Das Farbschema wird angezeigt. Die Grafik zeigt die relative Position der Module im ausgestreckten Zustand von IFT-A. Die pseudo-zweifach symmetrischen Heterodimere IFT144-IFT140 (c) und IFT122-IFT121 (d). Die zentralen TPR-Verbindungen, die durch die ersten vier TPRs gebildet werden, sind in schwarz gestrichelten Kästchen hervorgehoben, die rechts vergrößert sind. Die TPRs sind nummeriert und die eingefügte α-Helix in jeder Untereinheit ist mit einem Sternchen gekennzeichnet. e Eine andere Ansicht des Kopfmoduls mit IFT122 in der Oberflächendarstellung. f Nahaufnahmen des Interaktionsnetzwerks im Basismodul zwischen IFT122WD1 und IFT139C (1), zwischen IFT121WD1 und IFT43 (2), zwischen IFT121WD2 und IFT43 (3) und zwischen IFT43 und IFT139-IFT121-IFT122 (4).

Ungeachtet der erhaltenen pseudo-zweizähligen symmetrischen Organisation weisen die Kopf- und Basismodule gegensätzliche Strukturmerkmale auf. Im Kopfmodul machen die ~15-Reste-Linker zwischen dem zweiten WD40-Propeller und dem ersten TPR in IFT140 und IFT144 eine scharfe Kurve, sodass die Propeller von IFT140 und IFT144 in entgegengesetzte Richtungen weg von der zentralen Pseudo-Zweifaltigkeit zeigen Achse in einer länglichen Konformation (Abb. 2a, c). Der C-terminale ZBD von IFT122 verbindet sich mit der anderen Seite der IFT140-IFT144-TPR-Verbindung und bildet einen kompakten Kern, der weiter vom TPR-Array von IFT140 umgeben ist und eine insgesamt ca. 2500 Å2 vom Lösungsmittel freiliegende Oberfläche verbirgt (Abb. 2e). ). Von diesem Kern erstrecken sich die TPR-Arme von IFT122, IFT140 und IFT144, den variabelsten Segmenten im Kopfmodul (ergänzende Abbildung 3). Eine Frameshift-Mutation bei Tyr1077 in menschlichem IFT122ZBD (entspricht Lys1013 in Tetramymena IFT122ZBD), die den Kern des Kopfmoduls stören würde, verursacht das schwere Beemer-Langer-Syndrom mit frühem Kindstod oder kranioektodermaler Dysplasie37, was die wesentliche Rolle von IFT122ZBD bei der Organisation des Kerns des Kopfmoduls unterstreicht in IFT-A (Abb. 2e).

Im Gegensatz zur länglichen Konformation des Kopfmoduls nimmt das Basismodul eine kompakte Konfiguration ein (Abb. 2b). IFT121, IFT122 und IFT139 bilden zusammen einen geschlossenen ovalen Ring, wobei sich die N-terminalen TPRs von IFT139 (IFT139N, 1-694) in einer Magnetkonformation erstrecken (Abb. 2b). Die kurzen Linker (~5 Reste) zwischen den WD40-Propellern und den TPRs in IFT121 und IFT122 beschränken die Positionen der Propeller direkt über der IFT121-IFT122-TPR-Verbindung, um die Hälfte des ovalen Rings zu bilden (Abb. 2b). Diese Konformation wird durch ausgedehnte Kontakte zwischen IFT121 und IFT122 stabilisiert, die eine dem Lösungsmittel ausgesetzte Oberfläche des Basismoduls von ca. 3130 Å2 bedecken (Abb. 2b, d). Auf der anderen Seite passt der ZBD von IFT121 in eine spiralförmige Nut, die von den TPRs von IFT139 gebildet wird und die andere Hälfte des Basisrings bildet (Abb. 2b). Bemerkenswert ist, dass der ovale Ring des Basismoduls durch den C-terminalen Rest von IFT139, Lys1334, versiegelt ist, dessen aliphatische Seitenkette im hydrophoben zentralen Hohlraum von IFT122WD1 haftet (Abb. 2f). Das hochkonservierte Lysin oder Arginin von IFT139 in allen Organismen weist auf einen ähnlichen Verschlussmechanismus für das Basismodul von IFT-A hin (ergänzende Abbildung 6c).

Ein herausragendes Merkmal des Basismoduls besteht darin, dass IFT43, die kleinste Untereinheit des Komplexes, eine längliche Konfiguration annimmt und die Basis als molekulares Bindeglied durchquert, um die ringförmige Architektur zu stabilisieren (Abb. 2b, f und ergänzende Abb. 8). . Der N-Terminus von IFT43 (IFT43N) wandert entlang der Oberfläche der beiden WDs von IFT121, wobei die aromatischen Seitenketten von Trp9-Phe11 und Trp33 tief in die hydrophoben Taschen von IFT121WD1 bzw. IFT121WD2 eingebettet sind und die beiden Propeller in einer festen Ausrichtung einklemmen Basismodul (Abb. 2f). Bemerkenswerterweise wurde IFT43N in kürzlich gemeldeten IFT-A-Strukturen nicht beobachtet27,28,29,30. Die C-terminale Hälfte von IFT43 (IFT43C) faltet sich in sechs separate Helixe (α1-α6), die sich entlang der Oberfläche von IFT121 und IFT122 schlängeln und eine für Lösungsmittel zugängliche Oberfläche von ca. 3730 Å2 im Basismodul vergraben (Abb. 2f). Insbesondere füllen die Helixe α1-α3 den freien Bereich zwischen IFT121ZBD und IFT139, während die Helix α4 eine tiefe Furche einnimmt, die von IFT122WD2 und IFT121ZBD gebildet wird (Abb. 2f). Der Verlust von IFT43 führt zur Instabilität von IFT-A und sogar zum Verlust von Flagellen14, was die Bedeutung der molekularen Klebefunktion von IFT43 beim Aufbau des Basismoduls von IFT-A unterstreicht.

Um die Beziehung zwischen den Kopf- und Basismodulen in Apo IFT-A aufzudecken, passen wir die Strukturen dieser Module mit manuellen Anpassungen in die länglichen und gefalteten IFT-A-Dichtekarten ein, um die Atommodelle des gesamten IFT-A-Komplexes in beiden zu generieren Staaten (Abb. 3a). Der Strukturvergleich zeigt, dass einzelne Kopf- und Basismodule in diesen beiden Zuständen nahezu identisch sind (Abb. 3a und ergänzende Abb. 9). Der auffälligste Unterschied zwischen den länglichen und gefalteten IFT-A-Strukturen besteht in der Untereinheit IFT122, deren Struktur definiert, wie die beiden Module in den beiden Zuständen verbunden sind (Abb. 3a, b). Im verlängerten Zustand beginnt das TPR-Array von IFT122 an der IFT121-IFT122-Verbindung im Basismodul und steckt dann in vollständig verlängerter Weise im Kern des Kopfmoduls (Abb. 3b). Im krassen Gegensatz dazu führt das TPR-Array zwischen der vierten und fünften Wiederholung eine scharfe Biegung durch, sodass das gesamte Kopfmodul als starrer Körper auf die Basis zurückklappt (Abb. 3b). Die 11 Reste umfassende Schleife zwischen den TPR-Wiederholungen 4 und 5 von IFT122 (Schleife-45, Reste 707–717), die sowohl im verlängerten als auch im gefalteten Zustand ungeordnet ist, fungiert als Scharnier mit hoher Flexibilität, um die große Konformationsänderung von IFT-A währenddessen zu bewältigen der Übergang zwischen den beiden Zuständen (Abb. 3b und ergänzende Abb. 6b). Im Gegensatz zu den peripheren Positionen im verlängerten Zustand sind die langen TPR-Arme von IFT140 und IFT144 im gefalteten Zustand von den WDs von IFT140 und den TPRs von IFT121, IFT122 und IFT139 umgeben (Abb. 3c). Diese engen Kontakte führen folglich dazu, dass eine für Lösungsmittel zugängliche Oberfläche von ca. 1000 Å2 zwischen den Kopf- und Basismodulen vergraben wird, was darauf hindeutet, dass der gefaltete Zustand energetisch günstiger ist als der verlängerte Zustand (Abb. 3c).

a Die Atommodelle der verlängerten (links) und gefalteten (rechts) Zustände von IFT-A. IFT-A-Proteine sind wie in Abb. 1a gefärbt. Der gefaltete Zustand überlagert den gestreckten Zustand anhand der Struktur des Basismoduls, während dessen Kopfmodul grau eingefärbt ist. b Vergleich des TPR-Arms von IFT122 in den beiden Staaten. IFT122 ist wie in Abb. 1a gefärbt, während der verbleibende Teil von IFT-A wie in Abb. 1e gefärbt ist. Überlagerung der Biegestelle von IFT122 in den beiden Zuständen. Die ersten vier TPRs sind blassblau gefärbt, während das fünfte TPR und Loop-45 im ausgestreckten Zustand grün bzw. im gefalteten Zustand hellgrün gefärbt sind. c Die Schnittstelle zwischen Kopf- und Basismodul im gefalteten (links) und ausgestreckten Zustand (rechts). IFT140TPR und IFT144TPR sind wie in Abb. 1a gefärbt, IFT139TPR, IFT121TPR, IFT122TPR und IFT140WD wie in Abb. 1e und der Rest von IFT-A in hellgrau. d Diagramm der relativen Kopf-Basis-Ausrichtung mit zwei Clustern, die dem verlängerten bzw. gefalteten Zustand entsprechen. Die relative Ausrichtung zwischen den beiden Modulen im zusammengebauten IFT-A im anterograden Zug wird durch einen roten Kreis gekennzeichnet. Dargestellt sind die Kopfbewegungen im gestreckten Zustand.

Um die Dynamik der Kopf- und Basismodule im IFT-A-Komplex weiter zu untersuchen, haben wir den Bereich der relativen Positionen zwischen den beiden Modulen berechnet, indem wir die Winkelzuordnungen der Partikel aus fokussierten Rekonstruktionen verwendet haben. Diese Analyse enthüllte zwei Hauptklassen von IFT-A-Konformationen mit unterschiedlichen Merkmalen (Abb. 3d). Die erste Klasse entspricht dem gefalteten Zustand mit einer engen Winkelverteilung, während die zweite Klasse dem verlängerten Zustand mit einer breiteren Winkelverteilung entspricht, in dem sich die Kopf- und Basismodule um ~30° relativ zueinander biegen könnten (Abb. 3d und Ergänzung). Film 1). Wir schlagen vor, dass die durch unsere Kryo-EM-Rekonstruktion erfassten verlängerten und gefalteten Konformationen zwei lokale Energieminimumzustände des Apo-IFT-Komplexes im Konformationsraum in wässriger Lösung darstellen. Im Gegensatz dazu wurde in anderen IFT-A-Strukturen, über die kürzlich berichtet wurde, nur die verlängerte Konformation mit lokalen Schwankungen identifiziert 27, 28, 29, 30.

Das Atommodell des Apo-IFT-A-Komplexes bietet uns eine einzigartige Gelegenheit, die molekulare Grundlage dafür zu verstehen, wie der IFT-A-Komplex durch Polymerisation in den IFT-Zug eingebaut wird. Unser Ziel war es, die IFT-A-Strukturen in die 20,7-Å-Kryo-ET-Dichtekarte des anterograden IFT-Zuges der Grünalge Chlamydomonas27 einzupassen. Wir fanden deutlich heraus, dass die starren Kopf- und Basiskerne mit hohen Kreuzkorrelationswerten von 0,80 bzw. 0,78 eindeutig einzeln in die anterograde Zugdichte eingepasst werden können (Abb. 4a), was darauf hindeutet, dass der Apo-IFT-A in einer vorgeformten, bimodulare Konformation vor der Einbindung in den Zug11,13,14,38.

a Einpassen von IFT-A in die Kryo-ET-Dichtekarte des anterograden Zuges. Die Kopf- und Basiskerne sind hellgelb und blassblau gefärbt (siehe Abb. 1e), und die flexiblen TPRs im länglichen und zusammengebauten Zustand sind rosa bzw. orange gefärbt. b Genaue Ansichten der intermolekularen Wechselwirkungen zwischen IFT121ZBD und IFT139N (1), zwischen IFT140WD und IFT121WD (2), zwischen IFT144TPR und IFT140TPR (3-4) und zwischen IFT144ZBD und IFT139N (5). c Einpassen der Atommodelle von Tetrahymena IFT-A und Chlamydomonas IFT-B in die anterograde Zugkarte, wodurch die mutmaßlichen [IFT-A]-[IFT-B]-Schnittstellen enthüllt werden. IFT-A stammt aus dieser Studie und ist wie in Abb. 1a gefärbt, und IFT-B stammt von Lacey et al. mit IFT172 (Reste 1-1104) in Cyan, IFT88 (Reste 122-690) in Gelb, IFT74 (Reste 135-340) in Orange und der Rest von IFT-B in Hellbraun. Der EMDB-Code des Mikrotubuli-Dubletts (MTD) lautet EMD-20631. Die PDB-Codes von IFT-B, der Dynein-2-Motordomäne und der Schwanzdomäne lauten 8BD7, 6RLA bzw. 6RLB. d Periodische Anordnung des anterograden Zuges. Sechs IFT-B, drei IFT-A und zwei Dynein-1b in einer periodischen Einheit sind als c eingefärbt, während der Rest in Grau dargestellt ist.

Die Berechnung der relativen Ausrichtung zwischen den Kopf- und Basismodulen von IFT-A im anterograden IFT-Zug zeigte deutlich, dass IFT-A im anterograden Zug eher dem verlängerten als dem gefalteten Zustand ähnelt (Abb. 3d). Der verlängerte Apo IFT-A kann über eine Reihe von Konformationsänderungen an die Kryo-ET-Dichtekarte des anterograden Zuges angedockt werden (Abb. 4a und Zusatzfilm 2). Erstens ermöglicht ein leichtes Anziehen der Drehung in IFT139N, dass diese Magnetstruktur genau in das freie Volumen am unteren Rand der anterograden Karte passt und IFT121ZBD vom benachbarten IFT-A aus kontaktiert (Abb. 4a, b und ergänzende Abb. 10). . Diese Anpassung von IFT139N polymerisiert die IFT-A-Komplexe mit einem sich wiederholenden [-IFT139N-IFT121ZBD-]n-Muster im anterograden Zug (Abb. 4a, b). Währenddessen dreht sich der Kopfkern um ca. 50° gegen den Uhrzeigersinn um das Loop-45-Scharnier in IFT122, um in die entsprechende Position im anterograden Zug zu passen, in der WD1 von IFT140 Kontakt mit dem benachbarten WD1 von IFT121 an der −1-Position herstellt (Abb. 4a, b). Dann lösen sich die flexiblen TPR-Arme von IFT140 und IFT144 aus ihren gebündelten Positionen in der Nähe des zentralen TPR-Arms von IFT122, erstrecken sich in entgegengesetzte Richtungen und verbinden sich mit den TPR-Armen von IFT144 und IFT140 aus den benachbarten IFT-A-Komplexen an den +1- und IFT-A-Komplexen −1 Positionen (Abb. 4a, b). Durch die Iteration dieses Prozesses wird die Tandemverbindung von IFT-A im anterograden Zug in einer Arm-in-Arm-Manier hergestellt (Abb. 4a, b). Bemerkenswerterweise stellt IFT144ZBD im Zug auch eine Verbindung mit IFT139N vom IFT-A-Komplex an der Position −2 her, was darauf hindeutet, dass die Struktureinheit von IFT-A im anterograden Zug aus drei aufeinanderfolgenden miteinander verbundenen IFT-A-Komplexen besteht (Abb. 4b). ). In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung führen zwei Mutationen im menschlichen IFT144, C1253Y und C1267Y (entspricht C1286 und C1300 in Tetrahymena IFT144), die die Zinkionenbindung stören, zu Nephronophthise und Jeune-Syndrom, was die wichtige Rolle von IFT144ZBD für die Ziliarfunktion unterstreicht39,40. Insgesamt stabilisiert diese polymerisierte, stark vernetzte Konfiguration im anterograden Zug IFT-A in einer vollständig ausgedehnten Konformation, die ansonsten im Vergleich zu den verlängerten und gefalteten Apo-Zuständen von IFT-A ungünstig ist (Abb. 4b).

Dieses Modell enthüllte zwei unterschiedliche IFT-A-Oberflächen aus der radikalen Richtung im anterograden Zug. Die äußere Oberfläche ist mit WDs angereichert, die an der Zilienmembran anliegen und eine wesentliche Rolle bei der Abgabe verschiedener membranbindender Proteine spielen (Abb. 4c)9,41,42,43. Die Innenfläche auf der anderen Seite von IFT-A ist durch konvex geformte TPR-Cluster aus IFT140, IFT144 und IFT139 gekennzeichnet (Abb. 4c und ergänzende Abb. 11). Um mehr Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen IFT-A und IFT-B im anterograden Zug zu erhalten, haben wir ein pseudoatomares Modell erstellt, indem wir unsere zusammengesetzte IFT-A-Struktur und die veröffentlichte IFT-B-Struktur in eine zusammengesetzte Karte des anterograden IFT angedockt haben Zug (Abb. 4c)27. Das Modell enthüllt drei mutmaßliche Kontaktbereiche zwischen IFT-A und IFT-B: IFT140IFT-A-IFT172IFT-B, IFT144IFT-A-IFT88IFT-B und IFT139IFT-A-IFT74/IFT81IFT-B (Abb. 4c). im Einklang mit früheren biochemischen Studien15,27,29,44,45,46,47. Diese zusammengesetzte Konfiguration von IFT-A im anterograden Zug steht im Einklang mit der Vorstellung, dass die strukturelle Einheit der anterograden Züge aus IFT-A, IFT-B und Dynein-1b im Verhältnis 3:6:2 besteht (Abb . 4d)15.

Bis heute sind mehr als 140 pathogene Missense-Mutationen in IFT-A in der Human Gene Mutation Database (HGMD, http://www.hgmd.cf.ac.uk/) registriert (Ergänzende Abbildungen 6, 12 und ergänzende Daten). 2). Die hohe Sequenzkonservierung von IFT-A-Proteinen zwischen verschiedenen Organismen ermöglicht es uns, die pathogenen Mechanismen von Missense-Mutationen in menschlichem IFT-A zu untersuchen (Abb. 5). Die Strukturanalyse des Tetrahymena-IFT-A-Komplexes im anterograden Zug zeigt, dass diese krankheitsverursachenden Mutationen in vier verschiedene Gruppen eingeteilt werden können: Mutationen in den WDs von IFT-A-Proteinen (Typ I); Mutationen an der [IFT-A]-[IFT-A]-Assemblierungsschnittstelle (Typ II); Mutationen an der [IFT-A]-[IFT-B]-Assemblierungsschnittstelle (Typ III); und Mutationen an der Komponentenschnittstelle innerhalb des IFT-A-Komplexes (Typ IV) (Abb. 5 und ergänzende Abb. 12). Angesichts der Tatsache, dass alle IFT-A-WDs direkt der Zilienmembran zugewandt sind, haben die meisten Typ-I-Mutationen in WDs wahrscheinlich direkt oder indirekt negative Auswirkungen auf den Frachtverkehr, indem sie die Faltung und/oder Stabilität der WDs beeinträchtigen (Abb. 4c und 5). . Im Gegensatz dazu würden Mutationen an Typ-II- und -III-Schnittstellen die IFT-A-Polymerisation in den anterograden IFT-Zug beeinträchtigen (Abb. 4c, 5 und ergänzende Abb. 12), während Mutationen vom Typ IV zur Instabilität des IFT führen würden -A-Komplex (Abb. 2a, b und 5). Bemerkenswerterweise befinden sich alle Typ-III-Mutanten entweder in IFT144C oder in IFT139N, was mit der Beobachtung übereinstimmt, dass sich sowohl IFT144 als auch IFT139 an der Schnittstelle zwischen IFT-A und IFT-B befinden (ergänzende Abbildung 12). Interessanterweise ist menschliches IFT139 trotz seiner peripheren Position in IFT-A und fehlender WDs eine häufig krankheitsverursachende Untereinheit unter allen IFT-A-Proteinen (Abb. 5, ergänzende Abbildungen 6, 12 und ergänzende Daten 2). Insbesondere Mutationen, die das Meckel-Gruber-Syndrom (MKS), eine tödliche autosomal-rezessiv vererbte angeborene Anomalie, verursachen, kommen nur in IFT139 vor (Abb. 5 und ergänzende Daten 2), was die wesentliche Rolle von IFT139 für die Zilienfunktion unterstreicht21,38, 48.

Die pathogenen Mutationen von IFT-A können basierend auf ihrer Rolle bei der Frachtlieferung oder der IFT-Zugmontage in vier verschiedene Kategorien (Typ I, II, III und IV) eingeteilt werden.

In dieser Studie haben wir die Kryo-EM-Struktur des IFT-A-Komplexes bestimmt, die uns eine einzigartige Gelegenheit bietet, die Architektur von IFT-A, seinen Einbau in den IFT-Zügen und seine Rolle beim motorgetriebenen Gütertransport innerhalb von Zilien zu verstehen. IFT-A-Proteine finden sich sowohl in den anterograden und retrograden Zügen als auch im Zytoplasma mit der stärksten Verteilung an der Zilienbasis5,18,49. Es war unklar, ob diese IFT-A-Komponenten den IFT-A-Komplex zu dem Zeitpunkt zusammenbauen, zu dem sie in die IFT-Züge eingebaut werden, oder ob sie den IFT-A-Komplex zunächst im Zytoplasma vor dem Einbau in die Züge zusammenbauen. Die hier beschriebene Reinigung und Visualisierung endogener Tetrahymena-IFT-A-Komplexe legt nahe, dass der IFT-A-Komplex höchstwahrscheinlich als vormontierter bimodularer Komplex an der Zilienbasis vorliegt (Abb. 1). Konsequenterweise wurden in einer kürzlich durchgeführten Studie rekombinant exprimierte humane IFT-A-Proteine gemischt, um den humanen IFT-A-Komplex zu erhalten, dessen Struktur, obwohl sie auf atomarer Ebene nur teilweise aufgelöst ist, der verlängerten Konformation des Tetrahymena-IFT-A-Komplexes ähnelt die Vorstellung, dass IFT-A-Komponenten in Lösung spontan den IFT-A-Komplex bilden könnten, bevor sie in die IFT-Züge eingebaut werden (Abb. 1)29. Dieser hocheffiziente, hierarchische Mechanismus ist ein gemeinsames Merkmal des Aufbaus von Biomakromolekülen. Ein gutes Beispiel hierfür ist der Kernporenkomplex, dessen Bildung eine Hierarchie von Aufbauschritten wohldefinierter Unterkomplexe umfasst.

Während des schrittweisen Aufbaus des anterograden IFT-Zugs an der Ziliarbasis heftet sich zunächst die selbstpolymerisierte IFT-B-Anordnung an die Mikrotubuli, und dann wird der IFT-A-Komplex in den Zug auf dem den Zilien zugewandten Rückgrat von IFT-B eingebaut Membran (Abb. 6)31. Es wurde berichtet, dass IFT74IFT-B und IFT139IFT-A für die Zuordnung zwischen IFT-A und IFT-B15,47 erforderlich sind. Dementsprechend zeigt die Modellanpassung unserer hochauflösenden IFT-A-Struktur in die In-situ-Dichtekarte des anterograden Zugs der Grünalge Chlamydomonas, dass sich IFT74IFT-B in unmittelbarer Nähe zu IFT139IFT-A befindet (Abb. 4c und ergänzende Abb. 11). 15,27. Wir schlagen vor, dass das vormontierte IFT-A die Montage auf dem IFT-B-Gerüst durch die Interaktion zwischen IFT74IFT-B und IFT139IFT-A initiiert, was die Drehung der N-terminalen TPRs von IFT139IFT-A induziert, um die Interaktion von IFT139IFT-A zu ermöglichen mit benachbartem IFT121IFT-A, um alle IFT-A-Basismodule im Zug zu polymerisieren (Abb. 4a und ergänzende Abb. 11)27. Zusätzlich zum IFT139IFT-A-IFT74IFT-B-Kontakt im IFT-A-Basismodul zeigt die Einpassung von IFT-A in den anterograden Zug auch räumliche Nähe zwischen IFT88IFT-B und IFT144IFT-A sowie zwischen IFT172IFT-B und IFT140IFT-A ( Abb. 4c und ergänzende Abb. 11)29,44,45,46. Wir spekulieren, dass diese beiden Kontakte zwischen IFT-A und IFT-B mit einer Kaskade von Ereignissen einhergehen, um die Integration von IFT-A in den anterograden Zug zu vervollständigen, einschließlich der Drehung des IFT122-Stamms und der Aufdrehung der TPR-Arme von IFT140 und IFT144 als Herstellung der IFT140-IFT144-Verbindung zwischen benachbarten IFT-A-Komplexen im Arm-in-Arm-Stil (Abb. 4b). Zur weiteren Verifizierung dieses Modells sind höher aufgelöste In-situ-Strukturinformationen des anterograden IFT-Zuges erforderlich.

IFT-A-Komplexe aus dem Zusammenbau frisch exprimierter IFT-A-Untereinheiten und dem Abbau retrograder IFT-Züge sind in den Basalkörperchen konzentriert. Vormontierte bimodulare IFT-A werden durch Biegen an den Scharnierbereichen und Drehungen der flexiblen TPRs in den anterograden IFT-Zug integriert. Nach Erreichen der Spitze lösen sich IFT-A und IFT-B vom anterograden Zug, wahrscheinlich durch Anpassungen an den Scharnierregionen und den flexiblen TPRs, um den anterograden Zug in den locker zickzackförmigen retrograden Zug umzuwandeln. Schließlich bewegen sich die retrograden Züge zurück zu den Basalkörpern und IFT-A löst sich vom retrograden Zug, um einen Zyklus zu beenden. Offene Fragen zum Mechanismus der Drehung der Ziliarspitze und der retrograden Zugmontage sowie zur Rolle des gefalteten IFT-A-Komplexes im IFT-A-Zyklus warten auf weitere Untersuchungen.

Sobald sie die Ziliarspitze erreichen, werden die dicht gepackten anterograden IFT-Züge in retrograde Züge umgestaltet, die in rohen Tomogrammen eine lockere Zickzackform annehmen15,16,17,18,19,31,51. Wie werden dieselben IFT-A- und IFT-B-Komplexe zwischen diesen beiden Zuständen mit deutlich unterschiedlichen Konformationen umgewandelt? Ein hervorstechendes, gemeinsames Strukturmerkmal von IFT-A und IFT-B ist ihre bimodulare Architektur mit einem flexiblen Scharnierbereich in der Mitte (Abb. 1 und ergänzende Abb. 11)27. Ähnlich wie die Kopf- und Basismodule von IFT-A besteht IFT-B aus zwei stabilen Unterkomplexen IFT-B1 und IFT-B2, wie aus den 9,9-Å- bzw. 11,5-Å-In-situ-Kryo-ET-Dichtekarten hervorgeht (ergänzende Abbildung). . 11)27. Angesichts der Stabilität dieser Module ist es unwahrscheinlich, dass IFT-A und IFT-B im anterograden Zug vollständig in einzelne Untereinheiten zerlegt werden, bevor der retrograde Zug wieder zusammengesetzt wird (Abb. 6). Stattdessen schlagen wir vor, dass IFT-A und IFT-B mit Hilfe der aktiven Konfiguration von Dynein-1b die Biegung an den Gelenkregionen in Kombination mit Drehungen der flexiblen TPRs in den IFT-Proteinen wahrscheinlicher machen, um den anterograden Zug in umzuwandeln der zickzackförmige retrograde Zug unter Beibehaltung der internen Strukturen jedes Moduls in IFT-A und IFT-B (Abb. 6).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier und von anderen vorgestellten hochauflösenden Atommodelle von IFT-A sehr ähnliche längliche Konformationen zeigen und wertvolle Einblicke in den Aufbau des anterograden IFT-Zugs liefern27,28,29,30. Ein einzigartiges Ergebnis unserer Studie ist die Identifizierung des gefalteten Zustands von IFT-A, der sich deutlich von denen der verlängerten und anterograden IFT-A-Konformationen unterscheidet. Wir nehmen an, dass diese gefaltete Konformation ein Zustand ist, der mit IFT-A im retrograden Zug zusammenhängt, oder dass sie einen Zustand an der Ziliarspitze vor dem Zusammenbau retrograder IFT-Züge darstellt (Abb. 6). Zukünftige hochauflösende In-situ-Strukturstudien sind erforderlich, um diese Fragen zu beantworten und die Transportmechanismen sowohl anterograder als auch retrograder IFT-Züge zu verstehen.

Die Tetrahymena thermophila-Stämme B2086, CU428.2 und das Plasmid pFZZ-neo4 wurden vom Tetrahymena Stock Center (Cornell University) gekauft. Das FZZ-Tag im Plasmid wurde durch eine Schnittstelle der Tabak-Etch-Virus-Protease (TEV) zwischen Flag-Peptid (F) und Tandem-Protein-A-Domänenmodulen (ZZ) getrennt. Die letzten ca. 1.000 bp der IFT122-Kodierungssequenz und ca. 1.000 bp der 3'-untranslatierten Region (UTR) von IFT122 wurden separat aus genomischen DNAs von Tetrahymena amplifiziert und in den pFZZ-neo4-Vektor kloniert. Die Primer sind wie folgt aufgeführt:

Fw (IFT122) 5'-CGCTCTAGAACAACCTAATAAAAAAAAAAAAAAGCG-3',

Rev (IFT122) 5'-ATCGGATCCGAAATCAAAAACATCCTTCTAAGGTCC-3',

Fw (IFT122 3'UTR) 5'-TCAAGCTTAGCAAAAGCCTACAAATAATTAAAAG-3',

Rev (IFT122 3'UTR) 5'-CCCCTCGAGACACAAGACTTCGCACATAAAATG-3'.

Anschließend wurde das DNA-Fragment, das IFT122-FZZ-neo4 umfasst, durch doppelte Endonukleasen aus dem Vektor verdaut, durch Elektrotransformation in Konjuganten von B2086 und CU428.2 injiziert und am endogenen IFT122-Locus integriert. Anschließend wurden die Exkonjuganten in frisches Neff-Medium überführt und die Transformanten durch schrittweise Erhöhung der Paromomycin-Konzentration selektiert. Wenn sich die Zellen nicht innerhalb von 24 Stunden verdoppeln konnten, wurden einzelne Zellen durch BD Influx aussortiert und eine Woche lang in frischem Medium ohne Paromomycin kultiviert. Anschließend extrahierten wir genomische DNAs, verifizierten die Genotypen der Zellen durch quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR) und wählten Klone mit vollständigem Genersatz für die Kultur im großen Maßstab aus.

Zur Affinitätsreinigung wurden 20 l FZZ-IFT122 exprimierende Zellen in Neff-Medium bei 30 °C bis zur mittleren logarithmischen Phase (4 × 105 Zellen pro ml) kultiviert. Dann wurden die Zellen geerntet und in einem Puffer lysiert, der 50 mM HEPES (pH 7,4), 50 mM NaCl, 10 % (v/v) Glycerin, 0,05 % (v/v) IGEPAL CA-630 und 1 × Proteaseinhibitor-Cocktail (MedChem) enthielt Äußern). Nach der Ultraschallbehandlung und dem Zentrifugieren wurde der Überstand gesammelt und mit 400 µL IgG-Sepharose-6-Fast-Flow-Beads (GE Healthcare) 6 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Perlen mit Lysepuffer gewaschen und über Nacht mit TEV-Protease verdaut. Das Eluat der IgG-Perlen wurde 2 Stunden lang an Anti-DYKDDDDK G1-Affinitätsharz (GenScript) gebunden. Nach dem Waschen mit Lysepuffer wurde das IFT-A-Komplexprotein mit 2 ml 0,2 mg mL-1 Flag-Peptid in einem Puffer eluiert, der 50 mM HEPES (pH 7,4), 50 mM NaCl und 0,025 % (v/v) IGEPAL CA enthielt -630 und auf 20 µL bei 3 mg mL−1 konzentriert. Zur Analyse der Reinheit und Homogenität des IFT-A-Komplexes wurden Silberfärbung auf SDS-PAGE-Gel, nativem PAGE-Gel und Massenspektrometrie durchgeführt.

Kryo-EM-Gitter wurden mit dem Vitrobot Mark IV-Kolben (FEI) hergestellt, der auf 8 °C und 100 % Luftfeuchtigkeit eingestellt war. 2,5 µL Proteinprobe wurden auf ein glimmentladenes Au Quantifoil R1.2/1.3 300 Mesh Lochkohlenstoffgitter aufgetragen. Unmittelbar danach wurde eine Blotkraft von –1 und eine Blotzeit von 3 Sekunden angewendet, um die Gitter abzutupfen. Anschließend wurden die Proben auf Gittern durch Tauchgefrieren in vorgekühltem flüssigem Ethan bei einer Temperatur von flüssigem Stickstoff verglast.

Gefrorene hydratisierte Gitter wurden in ein 300-kV-FEI-Titan-Krios-G3i-Elektronenmikroskop geladen, das mit einem Gatan-K3-Direktelektronendetektor ausgestattet war. Die Daten wurden automatisch mit EPU-Software (FEI Eindhoven, Niederlande) erfasst. Verstärkungsnormalisierte Filme wurden bei einer Vergrößerung von 81.000 im Superauflösungsmodus (Pixelgröße von 0,55 Å) und in einem Defokussbereich zwischen –1,5 und –2,5 μm aufgenommen. Die Gesamtdosis von 50 e-/Å2 wurde in 32 Bilder aufgeteilt. Um die Auflösung zu verbessern, wurden für die in dieser Arbeit vorgestellten Strukturen insgesamt 66.729 Filmstapel erfasst.

Für jedes Einzelbild der ursprünglichen hochauflösenden Filmstapel wurde von MotionCor252 eine globale und lokale Bewegungskorrektur sowie eine Dosisgewichtung durchgeführt. Sowohl dosisgewichtete als auch ungewichtete Mikroaufnahmen wurden auf eine Pixelgröße von 1,1 Å mit einem Binning-Faktor von zwei verkleinert. Die dosisgewichteten Mikroaufnahmen wurden zur Partikelauswahl und weiteren Datenverarbeitung verwendet, und die nicht dosisgewichteten Aufnahmen wurden einer Suche nach Parametern der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) in Gctf53 unterzogen. Die Ausreißer der Vorverarbeitungsergebnisse wurden manuell herausgefiltert, indem die Bewegungs- und CTF-Anpassungsqualitäten überprüft wurden.

Für den ersten Datensatz wird eine anfängliche Gruppe von etwa 1000 Partikeln manuell ausgewählt und auf die referenzfreie 2D-Klassifizierung in RELION 3.054 angewendet. Die resultierenden 2D-Klassenmittelwerte wurden als Vorlagen für die automatische Partikelauswahl in Gautomatch (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/download/gautomatch-056/) verwendet. Alle Partikel wurden während der Extraktion normalisiert und um vier mit einer Boxgröße von 128 Pixeln gruppiert. Es wurden mehrere Runden von 2D-Klassifizierungsarbeiten durchgeführt, um Verunreinigungen und laute Partikel zu entfernen. Anschließend wurden die ausgegebenen Partikel einer großen Anzahl von 3D-Klassifizierungsaufgaben mit unterschiedlichen Kombinationen aus Klassennummer und Regularisierungsparameter T unterzogen. Alle Partikel, die den Dichtekarten mit höherer Auflösung und niedrigerem Rauschpegel entsprachen, wurden zusammengeführt, Duplikate entfernt und dann erneut verwendet. extrahiert mit einer Pixelgröße von 1,1 Å. Die folgenden hochauflösenden Verarbeitungsschritte einschließlich maskierter Verfeinerung, 3D-Klassifizierung ohne Ausrichtung sowie lokaler Winkelsuche führen zu einer Dichtekarte, die sich als Basismodul von IFT-A mit einer Auflösung von 4,8 Å basierend auf dem Goldstandard Fourier erwies Cut-off-Kriterium der Schalenkorrelation (FSC) von 0,143. Eine neue Runde der Partikelauswahl wurde für alle Datensätze wiederholt, indem Projektionen dieser neu erhaltenen Dichtekarte verwendet wurden. Der neue Partikelsatz wurde auf eine Pixelgröße von 4,4 Å gruppiert, durch Runden der 2D-Klassifizierung bereinigt und schließlich einer 3D-Klassifizierung mit einem größeren Partikeldurchmesser von 320 Å unterzogen. Als Ergebnis wurden alle Dichtekarten einschließlich des Basismoduls von IFT-A und vollständiger IFT-A-Komplexe im verlängerten und gefalteten Zustand erhalten. Durch Optimierung des Maskendurchmessers der Partikel, Partikelrezentrierung und weitere 3D-Klassifizierung wurden die Gesamtauflösungen der Karten für das Basismodul, IFT-A im gefalteten Zustand und IFT-A im verlängerten Zustand schließlich auf 3,6 Å, 8,8 Å und verbessert 8,5 Å. Nach Bayes'scher Politur und CTF-Verfeinerung wurden die Dichtekarten des Kopfmoduls auf 4,2 Å (IFT1401-1081 rückverfolgbar) bzw. 4,6 Å (vollständige IFT140 rückverfolgbar) verbessert. Zur besseren Visualisierung des flexiblen IFT139N (Reste 1–694) im Basismodul und des IFT144C (Reste 1130–1387) im Kopfmodul wurden die Basis- und Kopfdichtekarten schließlich bei 4,7 Å bzw. 6,0 Å durch Signal aufgelöst Subtraktion, Klassifizierung ohne Ausrichtung und lokale Winkelsuche. Lokale Auflösungsschwankungen werden von ResMap55 geschätzt.

Wir kombinierten De-novo-Modellbau und Starrkörper-Andocken, um die Atommodelle des IFT-A-Komplexes zu erstellen. Um Modelle von IFT-A in Coot manuell zu erstellen, haben wir uns für die Komponentenzuordnung auf die einzigartigen Reste mit großen Seitenketten am Anfang und Ende jeder Domäne konzentriert. Aromatische Reste am Anfang (Reste 1–10) und am Ende (Reste 331–340) von IFT121WD1 ermöglichten uns die Unterscheidung von IFT121 von IFT122. In ähnlicher Weise ermöglichte uns das letzte β-Faltblatt von IFT140WD2 (Reste 705–714), IFT140 von IFT144 zu unterscheiden. Die Kontinuität der Dichtekarten des Basismoduls bei 3,6 Å und des Kopfmoduls bei 4,2 Å ermöglichte es uns, die meisten IFT-A-Reste eindeutig zu verfolgen. Aufgrund der Flexibilität wurde AlphaFold-2 zur Unterstützung der Modellbildung für IFT139N (Reste 1–694) des Basismoduls, IFT144WD1, IFT144C (Reste 1130–1387) und IFT140C (Reste 1082–1407) des Kopfmoduls32 eingesetzt. Das endgültige Modell des gesamten Komplexes wurde von PHENIX iterativ verfeinert und von MolProbity56,57 validiert. Die Statistiken zur Datenerfassung und -verfeinerung sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Wir verwendeten die 20,7-Å-In-situ-Kryo-ET-Karte von IFT-A, die in der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) hinterlegt ist, und unsere Struktur von IFT-A im verlängerten Zustand, um ein pseudoatomares Modell des zusammengesetzten IFT-A-Polymers zu erstellen27 . Aufgrund der Stabilität der Kopf- und Basiskerne und der Flexibilität der TPRs haben wir zunächst die flexiblen TPRs einschließlich IFT122 (Reste 707–837), IFT139 (Reste 1–766), IFT140 (Reste 1035–1407) und IFT144 ( Reste 966–1387) aus der Struktur von IFT-A im verlängerten Zustand. Die einzigartigen Konformationen der Kopf- und Basismodulkerne ermöglichten es uns, sie mit hohen Kreuzkorrelationswerten (0,80 bzw. 0,77) eindeutig in die Kryo-ET-Karte von IFT-A einzuordnen. Anschließend haben wir die flexiblen TPRs manuell angepasst, ohne ihre Topologien zu ändern, um sie an die Dichte anzupassen, und das Strukturmodell des zusammengebauten IFT-A erstellt. Zuletzt wurden mehrere Kopien des zusammengesetzten IFT-A-Modells an die IFT-A-Karte angedockt. Um das Interaktionsnetzwerk zwischen IFT-A und IFT-B zu untersuchen, wurde eine zusammengesetzte Karte des anterograden IFT-Zugs durch Andocken von IFT-A (bei 20,7 Å, EMD-15980) und IFT-B (bei 9,9 Å, EMD-15977) erstellt ) in einen sich zusammensetzenden IFT-Zug (bei 29,9 Å, EMD-15261)27,31. Mikrotubuli (EMD-20631) wurde unter Bezugnahme auf eine frühere Studie15 platziert. Anschließend wurden Strukturmodelle des zusammengesetzten IFT-A (diese Studie), IFT-B (PDB-8BD7) und menschlichen Dynein-2 (PDB-6RLA und 6RLB, Dynein-1b in Chlamydomonas reinhardtii) in die zusammengesetzte Karte eingepasst Generieren Sie ein pseudoatomares Modell des anterograden IFT-Zugs. Abbildungen der EM-Dichtekarten und Atommodelle wurden mit UCSF ChimeraX und PyMol58 erstellt.

Für den verlängerten und gefalteten Zustand wurden zwei Cluster von Partikelbildern verwendet, um die entsprechenden Dichtekarten zu erhalten und die Verteilung der relativen Orientierungen zwischen den Kopf- und Basismodulen zu berechnen. Jeder Partikelcluster wurde gemäß den Ergebnissen früherer Konsensverfeinerungen neu zentriert und sowohl am Kopf als auch an der Basis erneut extrahiert. Unter Verwendung der Karte des verlängerten Zustands, die auf 10 Å tiefpassgefiltert wurde, als Referenz wurden maskierte Verfeinerungen an den rezentrierten Partikelbildern durchgeführt, um die Kopf- bzw. Basiskarten zu rekonstruieren. Als Ergebnis wurden jedem Partikel zwei Gruppen von Euler-Winkeln neu zugeordnet und dann wurden die entsprechenden Rotationsmatrizen für die Kopf- und Basiskarten erhalten. Die Rotationsmatrix, die die relative Rotation vom Kopf zur Basis angibt, wurde durch die Erstellung der Rotationsmatrix für den Kopf und der inversen Rotationsmatrix für die Basis berechnet. Basierend auf dieser Matrix wurden Euler-Winkel in der ZYX-Sequenz erhalten. Eine frühere Studie verwendete ebenfalls eine ähnliche Quantifizierungsmethode59. Für den Zustand des zusammengebauten IFT-A im anterograden Zug wurden die Rotationsmatrizen für Kopf und Basis mithilfe von ChimeraX generiert, um die entsprechenden Teile des anterograden Zugmodells an die Dichtekarte des verlängerten Zustands anzupassen58.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Kryo-EM-Karten des IFT-A-Komplexes wurden der Electron Microscopy Data Bank unter den Zugangsnummern EMD-34893 (IFT-A im verlängerten Zustand bei 8,5 Å), EMD-34894 (IFT-A im gefalteten Zustand bei 8,8 Å) übermittelt Å), EMD-34895 (Basismodul von IFT-A bei 3,6 Å), EMD-34896 (Basismodul von IFT-A bei 4,7 Å), EMD-34897 (Kopfmodul von IFT-A bei 4,2 Å), EMD- 34898 (Kopfmodul von IFT-A bei 4,6 Å) und EMD-34899 (Kopfmodul von IFT-A bei 6,0 Å), und die Atomkoordinaten wurden mit den Zugangscodes 8HMC (Basismodul von IFT-A) in der Proteindatenbank hinterlegt. A bei 3,6 Å), 8HMD (Basismodul von IFT-A bei 4,7 Å), 8HME (Kopfmodul von IFT-A bei 4,2 Å) und 8HMF (Kopfmodul von IFT-A bei 4,6 Å). Weitere Einzelheiten zu Datensätzen und Protokollen, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, werden auf begründete Anfrage vom entsprechenden Autor zur Verfügung gestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Nachury, MV & Mick, DU Festlegung und Regulierung der Zusammensetzung von Zilien für die Signalübertragung. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 20, 389–405 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reiter, JF & Leroux, MR Gene und molekulare Wege, die Ziliopathien zugrunde liegen. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 18, 533–547 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kozminski, KG, Johnson, KA, Forscher, P. & Rosenbaum, JL Eine Motilität im eukaryotischen Flagellum, die nichts mit dem Schlagen der Flagellen zu tun hat. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 90, 5519–5523 (1993).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ishikawa, H. & Marshall, WF Ciliogenese: Aufbau der Antenne der Zelle. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 12, 222–234 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cole, DG et al. Chlamydomonas-Kinesin-II-abhängiger intraflagellarer Transport (IFT): IFT-Partikel enthalten Proteine, die für den Ziliaraufbau in sensorischen Neuronen von Caenorhabditis elegans erforderlich sind. J. Cell Biol. 141, 993–1008 (1998).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Webb, S., Mukhopadhyay, AG & Roberts, AJ Intraflagellare Transportzüge und Motoren: Erkenntnisse aus der Struktur. Semin Cell Dev. Biol. 107, 82–90 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lucker, BF et al. Charakterisierung des B-Kerns des intraflagellaren Transportkomplexes: direkte Interaktion der Untereinheiten IFT81 und IFT74/72. J. Biol. Chem. 280, 27688–27696 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Taschner, M. et al. Die intralagellaren Transportproteine 172, 80, 57, 54, 38 und 20 bilden einen stabilen Tubulin-bindenden IFT-B2-Komplex. EMBO J. 35, 773–790 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Picariello, T. et al. Eine globale Analyse der IFT-A-Funktion zeigt eine Spezialisierung auf den Transport membranassoziierter Proteine in Zilien. J. Cell Sci. 132, jcs220749 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Scheidel, N. & Blacque, OE Intraflagelläre Transportkomplex-A-Gene regulieren die Zilienbildung und das Übergangszonen-Gating unterschiedlich. Curr. Biol. 28, 3279–3287.e2 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mukhopadhyay, S. et al. TULP3 verbindet den IFT-A-Komplex und Membranphosphoinositide, um den Transport von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in primäre Zilien zu fördern. Genes Dev. 24, 2180–2193 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Park, J. et al. dTULP, das Drosophila melanogaster-Homolog von Tubby, reguliert die Lokalisierung vorübergehender Rezeptorpotentialkanäle in Zilien. PLoS Genet 9, e1003814 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Behal, RH et al. Wechselwirkungen der Untereinheiten und Organisation der intraflagellären Transportkomplex-A-Proteine von Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 287, 11689–11703 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhu, B. et al. Funktionelle Untersuchung des IFT-A-Komplexes beim intraflagellaren Transport und der Ciliogenese. PLoS Genet 13, e1006627 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Jordan, MA, Diener, DR, Stepanek, L. & Pigino, G. Die Kryo-EM-Struktur intraflagellarer Transportzüge zeigt, wie Dynein inaktiviert wird, um eine unidirektionale anterograde Bewegung in Zilien sicherzustellen. Nat. Zellbiol. 20, 1250–1255 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chien, A. et al. Dynamik der IFT-Maschinerie an der Ziliarspitze. Elife 6, e28606 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Mijalkovic, J., van Krugten, J., Oswald, F., Acar, S. & Peterman, EJG Einzelmolekül-Umkehrungen des intraflagellaren Transports an der Ziliarspitze von C. elegans. Cell Rep. 25, 1701–1707.e2 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Iomini, C., Babaev-Khaimov, V., Sassaroli, M. & Piperno, G. Proteinpartikel in Chlamydomonas-Flagellen durchlaufen einen Transportzyklus, der aus vier Phasen besteht. J. Cell Biol. 153, 13–24 (2001).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pedersen, LB, Geimer, S. & Rosenbaum, JL Analyse der molekularen Mechanismen des intraflagellaren Transports bei Chlamydomonas. Curr. Biol. 16, 450–459 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Buisson, J. et al. Intralagellare Transportproteine zirkulieren zwischen dem Flagellum und seiner Basis. J. Cell Sci. 126, 327–338 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tran, PV et al. THM1 moduliert die Signaltransduktion von Maus-Sonic-Hedgehogs negativ und beeinflusst den retrograden intraflagellaren Transport in Zilien. Nat. Genet 40, 403–410 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iomini, C., Li, L., Esparza, JM & Dutcher, SK Retrograde intraflagellare Transportmutanten identifizieren komplexe A-Proteine mit mehreren genetischen Interaktionen in Chlamydomonas reinhardtii. Genetics 183, 885–896 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, E., Sivan-Loukianova, E., Eberl, DF & Kernan, MJ Ein IFT-A-Protein ist erforderlich, um funktionell unterschiedliche Zonen in mechanosensorischen Zilien abzugrenzen. Curr. Biol. 18, 1899–1906 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tsao, CC & Gorovsky, MA Tetrahymena IFT122A ist für den Zilienaufbau nicht unbedingt erforderlich, spielt aber eine Rolle bei der Rückführung von IFT-Proteinen von der Ziliarspitze zum Zellkörper. J. Cell Sci. 121, 428–436 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Blacque, OE et al. Das WD-Repeat-enthaltende Protein IFTA-1 ist für den retrograden intraflagellaren Transport erforderlich. Mol. Biol. Zelle 17, 5053–5062 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yuan, X. & Yang, S. Zilien/Ift-Protein und motorisch bedingte Knochenerkrankungen und Mausmodelle. Front Biosci. (Landmark Ed.) 20, 515–555 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lacey, SE, Foster, HE & Pigino, G. Die molekulare Struktur von IFT-A und IFT-B in anterograden intraflagellaren Transportzügen. Nat Struct Mol Biol (2023).

Meleppattu, S., Zhou, H., Dai, J., Gui, M. & Brown, A. Mechanismus der IFT-A-Polymerisation in Züge für den Ziliartransport. Zelle 185, 4986–4998.e12 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hesketh, SJ, Mukhopadhyay, AG, Nakamura, D., Toropova, K. & Roberts, AJ Die IFT-A-Struktur enthüllt Träger für den Membranproteintransport in Zilien. Zelle 185, 4971–4985.e16 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jiang, M. et al. Menschliche IFT-A-Komplexstrukturen liefern molekulare Einblicke in den Ziliartransport. Zellauflösung (2023).

van den Hoek, H. et al. Die In-situ-Architektur der Ziliarbasis zeigt den schrittweisen Aufbau intraflagellärer Transportzüge. Wissenschaft 377, 543–548 (2022).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Jumper, J. et al. Hochpräzise Vorhersage der Proteinstruktur mit AlphaFold. Natur 596, 583–589 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moosa, S. et al. Neuartige IFT122-Mutationen bei drei argentinischen Patienten mit kranioektodermaler Dysplasie: Erweiterung des Mutationsspektrums. Bin. J. Med Genet A 170A, 1295–1301 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Bredrup, C. et al. Ziliopathien mit Skelettanomalien und Niereninsuffizienz aufgrund von Mutationen im IFT-A-Gen WDR19. Bin. J. Hum. Genet 89, 634–643 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun, Y. et al. Gezielte Next-Generation-Sequenzierung als umfassender Test für Mendelsche Erkrankungen: eine kohortendiagnostische Studie. Wissenschaft. Rep. 8, 11646 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, M. et al. Mutationen im menschlichen IFT140 verursachen eine nicht-syndromale Netzhautdegeneration. Summen. Genet 134, 1069–1078 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Silveira, KC, Moreno, CA & Cavalcanti, DP Das Beemer-Langer-Syndrom ist eine Ciliopathie aufgrund biallelischer Mutationen in IFT122. Bin. J. Med Genet A 173, 1186–1189 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hirano, T., Katoh, Y. & Nakayama, K. Der Intraflagellar-Transport-A-Komplex vermittelt den Ziliareintritt und den retrograden Transport von Ziliar-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Mol. Biol. Zelle 28, 429–439 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, W. et al. Erweiterung der genetischen Architektur und des phänotypischen Spektrums bei Skelett-Ziliopathien. Summen. Mutat. 39, 152–166 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Stranneheim, H. et al. Integration der Sequenzierung des gesamten Genoms in ein Gesundheitsumfeld: hohe Diagnoseraten über mehrere klinische Einheiten hinweg bei 3219 Patienten mit seltenen Krankheiten. Genome Med 13, 40 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gotthardt, K. et al. Eine G-Protein-Aktivierungskaskade von Arl13B zu Arl3 und Auswirkungen auf das ziliare Targeting lipidierter Proteine. Elife 4, e11859 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Jacoby, M. et al. INPP5E-Mutationen verursachen bei Menschen und Mäusen primäre Signaldefekte im Zilium, Zilieninstabilität und Ziliopathien. Nat. Genet 41, 1027–1031 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fu, W., Wang, L., Kim, S., Li, J. & Dynlacht, BD Rolle des IFT-A-Komplexes beim selektiven Transport zum primären Cilium. Cell Rep. 17, 1505–1517 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kobayashi, T., Ishida, Y., Hirano, T., Katoh, Y. & Nakayama, K. Die Zusammenarbeit des IFT-A-Komplexes mit dem IFT-B-Komplex ist für den ziliaren retrograden Proteintransport und den GPCR-Import erforderlich. Mol. Biol. Zelle 32, 45–56 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ishida, Y., Kobayashi, T., Chiba, S., Katoh, Y. & Nakayama, K. Molekulare Basis von Ziliardefekten, die durch zusammengesetzte heterozygote IFT144/WDR19-Mutationen bei kranioektodermaler Dysplasie verursacht werden. Summen. Mol. Genet 30, 213–225 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Follit, JA, Xu, F., Keady, BT & Pazour, GJ Charakterisierung des Maus-IFT-Komplexes B. Cell Motil. Cytoskeleton 66, 457–468 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brown, JM, Cochran, DA, Craige, B., Kubo, T. & Witman, GB Die Montage der IFT-Züge an der Ziliarbasis hängt von IFT74 ab. Curr. Biol. 25, 1583–1593 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Davis, EE et al. TTC21B trägt sowohl kausale als auch modifizierende Allele im gesamten Ciliopathie-Spektrum bei. Nat. Genet 43, 189–196 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wingfield, JL et al. IFT trainiert in verschiedenen Stadien der Montage die Warteschlange an der Ziliarbasis für die aufeinanderfolgende Freisetzung in das Zilium. Elife 6, e26609 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Onischenko, E. et al. Reifungskinetik eines Multiproteinkomplexes durch metabolische Markierung aufgedeckt. Zelle 183, 1785–1800 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Stepanek, L. & Pigino, G. Mikrotubuli-Dublets sind zweigleisige Eisenbahnen für intraflagellare Transportzüge. Wissenschaft 352, 721–724 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Zheng, SQ et al. MotionCor2: Anisotrope Korrektur der strahlinduzierten Bewegung für eine verbesserte Kryo-Elektronenmikroskopie. Nat. Methoden 14, 331–332 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, K. Gctf: Echtzeit-CTF-Bestimmung und -Korrektur. J. Struktur. Biol. 193, 1–12 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zivanov, J. et al. Neue Werkzeuge zur automatisierten hochauflösenden Kryo-EM-Strukturbestimmung in RELION-3. Elife 7, e42166 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Swint-Kruse, L. & Brown, CS Resmap: Automatisierte Darstellung makromolekularer Grenzflächen als zweidimensionale Netzwerke. Bioinformatik 21, 3327–3328 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chen, VB et al. MolProbity: Validierung der Gesamtatomstruktur für die makromolekulare Kristallographie. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 66, 12–21 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Afonine, PV et al. Auf dem Weg zur automatisierten kristallographischen Strukturverfeinerung mit Phenix. verfeinern. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 68, 352–367 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF ChimeraX: Strukturvisualisierung für Forscher, Pädagogen und Entwickler. Proteinwissenschaft. 30, 70–82 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Webster, MW et al. Strukturelle Grundlagen der Transkriptions-Translations-Kopplung und Kollision in Bakterien. Wissenschaft 369, 1355–1359 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

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Wir danken den Mitarbeitern der Elektronenmikroskopie- und Massenspektrometrie-Einrichtung am Shanghai Institute of Precision Medicine für die technische Unterstützung und Unterstützung bei der Datenerfassung. Wir danken Wenyan Huang vom Shanghai Children's Hospital der Shanghai Jiaotong University School of Medicine für die Kommunikation über IFT-A-Erkrankungen. Diese Arbeit wurde vom National Key R&D Program of China (2016YFA0501800 an YM und 2018YFA0107004 und 2018YFC2000102 an ML), der National Natural Science Foundation of China (31930063 an ML, 32071189 an JW und 31971137 an CH) und dem Innovative Research Team von unterstützt High-Level Local University in Shanghai (SHSMU-ZLCX20211700 an ML, JW und YM) und Zuschussunterstützung für Gaofeng Clinical Medicine der Shanghai Municipal Education Commission (20181711 an JW).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yuanyuan Ma, Jun He.

Neuntes Volkskrankenhaus, Medizinische Fakultät der Jiao Tong-Universität Shanghai, Shanghai, 200011, China

Yuanyuan Ma, Jun He, Shaobai Li, Chenhui Huang, Jian Wu und Ming Lei

Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai, 200125, China

Yuanyuan Ma, Jun He, Shaobai Li, Chenhui Huang, Jian Wu und Ming Lei

Renji-Krankenhaus, Medizinische Fakultät der Jiao Tong-Universität Shanghai, Shanghai, 200032, China

Deqiang Yao

Staatliches Schlüssellabor für Onkogene und verwandte Gene, Medizinische Fakultät der Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200025, China

Ming Lei

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ML und JW haben das Projekt konzipiert. YM reinigte den IFT-A-Komplex, bereitete Kryo-EM-Proben vor und sammelte Datensätze. YM und SL bestimmten die Strukturen. JH, DY und JW führten den Modellbau und die Verfeinerung durch. Alle Autoren haben zur Dateninterpretation beigetragen. JW leistete einen wichtigen Beitrag zur Identifizierung des gefalteten Zustands von IFT-A. Und MLYMCH und JH haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Jian Wu oder Ming Lei.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Saikat Mukhopadhyay und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ma, Y., He, J., Li, S. et al. Struktureller Einblick in den intraflagellaren Transportkomplex IFT-A und seinen Aufbau im anterograden IFT-Zug. Nat Commun 14, 1506 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37208-2

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Eingegangen: 09. Dezember 2022

Angenommen: 06. März 2023

Veröffentlicht: 17. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37208-2

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