Entwicklung von Mikroglia

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1224 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Hier beschreiben wir die auf Mikroglia gerichteten adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektoren, die eine mutmaßliche 1,7 kb große Promotorregion des Mikroglia-/Makrophagen-spezifischen ionisierten Calcium-bindenden Adaptermoleküls 1 (Iba1) sowie wiederholte miRNA-Zielstellen für microRNA (miR) enthalten )-9 und miR-129-2-3p. Die 1,7-kb-Genomsequenz stromaufwärts des Startcodons in Exon 1 des Iba1-Gens (Aif1) fungiert als bevorzugter Mikroglia-Promotor im Striatum und Kleinhirn. Darüber hinaus wird die ektopische Transgenexpression in Nicht-Mikrogliazellen deutlich unterdrückt, wenn zwei Sätze von 4-wiederholten miRNA-Zielstellen für miR-9 und miR-129-2-3p hinzugefügt werden, die ausschließlich in Nicht-Mikrogliazellen exprimiert werden und AAV-Schwamm enthalten. abgeleitete mRNAs. Unsere Vektoren transduzierten verzweigte Mikroglia in gesunden Geweben und reaktive Mikroglia in mit Lipopolysaccharid behandelten Mäusen und einem Mausmodell für neurodegenerative Erkrankungen. Darüber hinaus ermöglichte die Live-Fluoreszenzbildgebung die Überwachung der Mikroglia-Motilität und der intrazellulären Ca2+-Mobilisierung. Daher sind auf Mikroglia gerichtete AAV-Vektoren wertvoll für die Untersuchung der Pathophysiologie und Therapie von Mikroglia, insbesondere im Striatum und Kleinhirn.

Mikroglia, bei denen es sich um Immunzellen im Zentralnervensystem (ZNS) handelt, sind dafür bekannt, dass sie Überwachungs- und Auffangfunktionen übernehmen. Neuere Studien haben jedoch verschiedene Funktionen von Mikroglia im ZNS aufgezeigt, darunter die Entwicklung des Gehirns1,2, die Umgestaltung neuronaler Schaltkreise1,3 und das Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen4,5,6.

Jüngste technologische Fortschritte haben die virale Expression verschiedener funktioneller Moleküle ermöglicht, die mit fluoreszierenden Proteinen markiert sind, wie etwa G-CaMP (Kalziumsensor)7 und ArcLightning (Membranspannungssensor)8 für die optische Aufzeichnung und verschiedene lichtempfindliche Ionenkanäle für die Optogenetik9. Unter diesen Umständen sind virale Vektoren, die in vivo gezielt Mikrogliazellen im Gehirn transduzieren, leistungsstarke Werkzeuge zur Erforschung der Funktion und des Verhaltens von Mikroglia in der natürlichen Gehirnumgebung. Darüber hinaus werden Mikroglia chemoangezogen an Läsionsstellen im Gehirn;10,11,12 somit können transduzierte Mikroglia genutzt werden, um ein therapeutisches Genprodukt an das verletzte Gewebe zu liefern.

Um ein Transgen in vivo an Mikroglia abzugeben, verwendete Jakobssons Gruppe lentivirale Vektoren mit einem Housekeeping-Phosphoglyceratkinase (PGK)-Promotor und vier wiederholten komplementären microRNA-9-Zielsequenzen (miR-9.T)13. Da miR-9 endogen in nicht-mikroglialen Zellen, aber nicht in Mikroglia exprimiert wurde, wurde die transgene Messenger-RNA (mRNA), die miR-9.T enthielt, ausschließlich in nicht-mikroglialen Zellen exprimiert, was zur selektiven Transgenexpression in Mikroglia führte. Dabei wurde gezeigt, dass es sich bei über 70 % der transduzierten Zellen im Striatum der Ratte um Mikroglia handelte13. Der Wechsel des PGK-Promotors zu einem starken Cytomegalovirus (CMV)-Promotor in der Transgenkassette lentiviraler Vektoren führt jedoch zu einem deutlichen Verlust der Transgenexpression in Neuronen und Astrozyten14. Darüber hinaus haben relevante Studien die Induktion von miR-9 in Mikroglia bei deren Aktivierung gezeigt15,16,17, was auf eine mögliche Unterdrückung der Transgenexpression in reaktiven Mikroglia schließen lässt.

Frühere Studien stellten die Transduktion von Mikroglia unter Verwendung von Adeno-assoziierten Viren (AAV) Serotyp 2, 5 und Mutanten-6-Kapsidvektoren in Frage, die Mikroglia-spezifische Promotoren wie die von F4/80 und CD6818,19 umfassten. Sie führten jedoch bei einigen „einzelnen Mikroglia-Targeting“ nur zu geringem Erfolg, wahrscheinlich aufgrund der schwachen Promotoraktivität und der geringen Bindungskapazität von AAV-Kapsiden an Mikroglia. Für die effiziente und selektive Transduktion von Mikroglia sind daher ein robuster mikrogliaspezifischer Promotor und ein mikrogliatropes AAV-Kapsid erforderlich. Unter den natürlich isolierten AAV-Kapsidtypen verursachten AAV1 und AAV9 in der Großhirnrinde und AAV1 im Striatum eine hohe Transgenexpression in Mikroglia. Allerdings zeigte AAV1 im Striatum neben Mikroglia auch eine Präferenz für Astrozyten und Neuronen20.

In dieser Studie entwickelten wir Mikroglia-zielende AAV2/9-Vektoren (AAV9-Kapsid und AAV2-Virusgenom), die eine mutmaßliche Promotorregion des Mikroglia-/Makrophagen-spezifischen ionisierten Calcium-bindenden Adaptermoleküls 1 (Iba1), miR-9.T, tragen. und zusätzliche Zielsequenzen, die komplementär an miR-129-2-3p gebunden sind, eine andere miRNA, die selektiv in nicht-mikroglialen Zellpopulationen im ZNS exprimiert wurde21,22,23.

Um das Mikroglia-Targeting zu testen, haben wir fünf AAV-Konstrukte hergestellt, die den PGK-Promotor oder mutmaßlichen Iba1-Promotor mit oder ohne Quadruplet-miRNA-Zielsequenzen für miR-9, miR-129-2-3p oder miR-136-5p tragen, wie dargestellt (Abb. 1a). –e). Die Mikroglia-Targeting-Profile dieser AAV-Konstrukte wurden in drei verschiedenen Gehirnregionen bewertet: der Großhirnrinde (frontaler Kortex), dem Striatum und dem Kleinhirn. Das Striatum wurde ausgewählt, um unsere Ergebnisse mit einem früheren Bericht über lentivirale Vektoren mit miR-9.T13 zu vergleichen, während neben dem Striatum auch der frontale Kortex und das Kleinhirn ausgewählt wurden, da abweichende Mikrogliafunktionen in diesen Hirnregionen mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht wurden , wie Alzheimer-Krankheit und Kleinhirnataxie24,25,26. Im Allgemeinen hängt das Transgen-Expressionsmuster von AAV von der Injektionsdosis und der anschließenden Inkubationszeit ab. Um nach Mikroglia-Targeting-Eigenschaften zu suchen, warteten wir eine Woche nach der Injektion von AAV mit einem relativ hohen Titer (3,9 × 1012 virales Genom (vg)/ml; Abb. 1f). Das Injektionsvolumen (0,5 μL für die Großhirnrinde, 1 μL für das Striatum und 10 μL für das Kleinhirn) wurde durch mehrere vorläufige Injektionsversuche unter Bezugnahme auf frühere Berichte bestimmt13,27. Nach Auswahl des am besten geeigneten AAV-Konstrukts für das Mikroglia-Targeting wurde die Inkubationszeit durch Senkung der Injektionsdosis verlängert, um die Spezifität der Mikroglia-Transduktion zu optimieren.

a–e AAV-Vektoren umfassen den konstitutiven PGK-Promotor (a) oder Iba1-Promotor (b–e), gefolgt von GFP, WPRE und polyA. Darüber hinaus wurden ein oder zwei Sätze von vier wiederholten microRNA (miR)-Zielsequenzen (4 × miR-9.T und 4 × miR-129-2-3p.T oder 4 × miR-136-5p.T) dazwischen eingefügt die WPRE- und polyA-Sequenzen (a, c–e). Jedes Konstrukt wurde wie beschrieben mit dem abgekürzten Promotornamen (PGK oder Iba1) plus eingearbeiteten miR-Zielen gekennzeichnet. f Mäuse erhielten unterschiedliche Dosen jedes AAV-Vektors (3,9 × 1012 vg/ml) in die Großhirnrinde (0,5 μL), das Striatum (1 μL) und das Kleinhirn (10 μL). Eine Woche nach der Virusinjektion wurden die Gehirne der behandelten Mäuse immunhistochemisch untersucht. GFP-verstärktes grün fluoreszierendes Protein, Iba1-ionisiertes Calcium-bindendes Adaptermolekül 1, IHC-Immunhistochemie, ITR-invertierte terminale Wiederholung, PGK-Phosphoglyceratkinase 1, PolyA-Affenvirus-40-Polyadenylierungssignalsequenz, posttranskriptionelles regulatorisches Element des Waldmurmeltier-Hepatitis-Virus WPRE.

Eine frühere Studie zeigte, dass die Injektion von lentiviralen Vektoren, die vier wiederholte Kopien von miR-9.T exprimierten, durch den PGK-Promotor in das Striatum erwachsener Ratten zur überwiegenden Transduktion von Mikroglia führte13. Die AAV2/9-Vektoren, die die Transgenkassette tragen und im Wesentlichen mit den lentiviralen Vektoren (AAV9.PGK.miR-9.T; Abb. 1a) identisch waren, wurden in die Großhirnrinde, das Striatum und das Kleinhirn injiziert. Eine Woche nach der Injektion wurden die Gehirne in Scheiben geschnitten und auf GFP und Iba1 immunmarkiert. Wir fanden heraus, dass die Mehrzahl der GFP-exprimierenden Zellen eine andere Morphologie als verzweigte Mikroglia aufwiesen und nicht mit Iba1 co-immunmarkiert waren (ergänzende Abbildung 1). Die quantitative Analyse zeigte, dass das Verhältnis von GFP- und Iba1-positiven Zellen zu GFP-positiven Zellen in der Großhirnrinde und im Striatum ~10 % oder weniger und im Kleinhirn 34 % betrug (Tabelle 1 und ergänzende Abbildung 1c).

Zuvor haben wir mithilfe von AAV-Vektoren mit zelltypspezifischen Promotoren, wie dem Promotor des fibrillären sauren Glia-Proteins (GFAP) (Astrozyten)28 und dem Promotor der neuronenspezifischen Enolase (NSE) (Neuronen)29, L7-6, erfolgreich bestimmte Zellpopulationen gezielt angegriffen Promotor [Kleinhirn-Purkinje-Zellen (PCs)]30 und Maus-Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) 65 (mGAD65)-Promotor (hemmende Neuronen)27. Insbesondere haben wir herausgefunden, dass die Genomsequenz vor dem ersten ATG eines zelltypspezifischen Gens häufig als zelltypspezifischer Promotor dient27,30. Deshalb haben wir uns entschieden, diese Strategie zu nutzen. In einer früheren Studie wurde eine 1,9-kb-Genomregion von Iba1 (Aif1) verwendet, die Exon 1, Intron 1 und einen Teil von Exon 2 enthielt, um Mikroglia-spezifische transgene Mäuse zu produzieren (ergänzende Abbildung 2a) . Daher haben wir getestet, ob die entsprechende genomische Region stromaufwärts des ersten ATG in Exon 1 des Iba1-Gens (ergänzende Abbildung 2a, b) beim Einbau in AAV-Vektoren (im Folgenden das 1678-bp-Maus-Iba1) auf Mikroglia-spezifische Weise funktioniert Die genomische Region wird als Iba1-Promotor bezeichnet. AAV2/9-Vektoren, die GFP über den Iba1-Promotor (AAV9.Iba1) exprimieren, wurden in der gleichen Dosis wie AAV9.PGK.miR-9.T in die Großhirnrinde, das Striatum und das Kleinhirn injiziert (Abb. 1b, f).

Eine Woche nach der Injektion wurde eine effiziente Transduktion von Mikroglia (GFP- und Iba1-doppelt-positive Zellen) im Striatum und Kleinhirn beobachtet (ergänzende Abbildungen 3e – g und h – j), wobei einige Iba1-negative nicht-mikrogliale Zellen transduziert wurden ( Pfeile in der ergänzenden Abbildung 3f, g, i, j). Im Gegensatz dazu waren die meisten GFP-exprimierenden Zellen in der Großhirnrinde Iba1-negative Pyramidenneuronen-ähnliche Zellen (ergänzende Abbildung 3b – d). Die quantitative Analyse zeigte, dass ~69 % bzw. ~86 % der GFP-positiven Zellen im Striatum bzw. Kleinhirn Iba1-positive Mikroglia waren, wohingegen Iba1-positive Mikroglia nur 2 % der GFP-exprimierenden Zellen in der Großhirnrinde behielten (Tabelle 1 und ergänzende Abb. 3k). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Iba1-Promotor bevorzugt in residenten Mikroglia im Striatum und Kleinhirn wirkt, nicht jedoch in der Großhirnrinde.

Wir haben miR-9.T-Sequenzen zu AAV9.Iba1 nach dem posttranskriptionellen Regulationselement (WPRE) des Waldmurmeltier-Hepatitis-Virus hinzugefügt (AAV9.Iba1.miR-9.T; Abb. 1c und ergänzende Abb. 4a). Die miR-Zielsequenz wurde viermal wiederholt, da frühere Berichte zeigten, dass der Grad der Zielunterdrückung zunahm, wenn die Anzahl der miR-Zielstellen zunahm32,33,34. Die Wirksamkeit jeder miR-Zielstelle im Konstrukt mit vier miR-Zielstellen war doppelt so hoch wie die jeder Stelle im Konstrukt mit zwei miR-Zielstellen, war jedoch ähnlich der des Konstrukts mit sechs miR-Zielstellen35. Im Hinblick auf die Wirksamkeit der Zielunterdrückung und die Einsparung von Unterbringungsraum für ein Transgen haben wir eine viermalige Wiederholung gewählt.

AAV transduzierte effizient verzweigte Mikroglia in allen drei Gehirnregionen (ergänzende Abbildung 4b – j). Allerdings wurden in der Großhirnrinde zahlreiche Iba1-negative nicht-mikrogliale Zellen, die durch große Somata gekennzeichnet sind, um das Epizentrum der Virusinjektionsstelle herum transduziert (ergänzende Abbildung 4b, d), wohingegen in einer entfernten Region eine selektive mikrogliale Transduktion beobachtet wurde vom Epizentrum (Ergänzende Abb. 4b, c). Die quantitative Analyse ergab, dass fast alle GFP-positiven Zellen im Striatum und Kleinhirn Iba1-positive Mikroglia waren, wohingegen das Verhältnis der transduzierten Mikroglia zur Gesamtzahl der transduzierten Zellen in der Großhirnrinde nur ~ 27 % betrug (Tabelle 1 und ergänzende Abbildung 4k). Daher führte die Hinzufügung der miR-9.T-Sequenz zu einer signifikanten Detargetierung nicht-mikroglialer Zellen in allen drei Hirnregionen, obwohl die nicht-mikrogliale Detargetierung in der Großhirnrinde unzureichend blieb.

Um die Transgenexpression in Nicht-Mikrogliazellen weiter zu unterdrücken, haben wir ein zusätzliches Quadruplex-microRNA-129-2-3p-Ziel (miR-129-2-3p.T) oder ein microRNA-136-5p-Ziel (miR-136-5p.T) eingebaut ) Sequenzen nach Quadruplex miR-9.T (AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T oder 136-5p.T) (Abb. 1d, e). Ähnlich wie bei miR-9 wurde gezeigt, dass sowohl miR-129-2-3p als auch miR-136-5p in Neuronen angereichert und in Mikroglia vermindert sind22, was darauf hindeutet, dass sowohl miR-129-2-3p als auch miR-136-5p wahrscheinlich supprimieren die Expression einer transgenen mRNA, die miRNA-Zielstellen in Nicht-Mikrogliazellen enthält. Wir injizierten diese AAVs ähnlich in drei verschiedene Gehirnbereiche und analysierten die Transgen-Expressionsprofile eine Woche nach der Virusinjektion immunhistochemisch. Die konfokale Mikroskopieanalyse der mit AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T behandelten Hirnschnitte ergab eine hochspezifische Mikroglia-Transduktion in allen drei Hirnregionen (Abb. 2a – j). Bemerkenswerterweise wurden Neuronen in der Großhirnrinde weitgehend enttarnt (Abb. 2b – d). Die quantitative Analyse zeigte, dass ~87 % der transduzierten Zellen in der Großhirnrinde und fast alle transduzierten Zellen im Striatum und Kleinhirn Mikroglia waren (Tabelle 1). Im Gegensatz zu miR-129-2-3p.T gelang es der Zugabe von miR-136-5p.T zu AAV9.Iba1.miR-9.T nicht, die nicht-mikroglialen Zellen in der Großhirnrinde zu entfernen (ergänzende Abbildung 5). ).

ein Schema des AAV-Konstrukts, das den Iba1-Promotor, GFP und zwei verschiedene Quadruplex-Sequenzen umfasst, die zu miR-9 und miR-129-2-3p komplementär sind. Mäuse erhielten unterschiedliche Dosen AAV (3,9 × 1012 vg/ml) in die Großhirnrinde (0,5 μL), das Striatum (1 μL) und das Kleinhirn (10 μL). Eine Woche nach der Virusinjektion wurden die Gehirne der Mäuse immunhistochemisch untersucht. (bd)Immunhistochemie der Großhirnrinde. Quadratische Bereiche in b wurden vergrößert. Beachten Sie die starke und effiziente GFP-Expression in Mikroglia mit schwacher und seltener Transduktion von Iba1-negativen nicht-Mikroglia-Zellen (Pfeile). e–j Hochspezifische Transduktion von Mikroglia im Striatum (e–g) und Kleinhirn (h–j). Quadratische Bereiche in (e, h) wurden vergrößert. Maßstabsbalken; 100 μm (b, e, h) und 20 μm (c, d, f, g, i, j). GL-Körnchenzellschicht, ML-Molekülschicht.

Als nächstes untersuchten wir die Transduktionseffizienz von Mikroglia, die durch Division des Prozentsatzes der GFP- und Iba1-doppelt-positiven Zellen (transduzierte Mikroglia) durch die Gesamtzahl der für Iba1 immunreaktiven Mikroglia ermittelt wurde. AAV-Vektoren in der getesteten Dosis transduzierten etwa 50–90 % der Mikroglia in allen drei Gehirnregionen (ergänzende Abbildung 6). In Gegenwart von miR-9.T wurde die Transduktionseffizienz durch den Wechsel vom PGK-Promotor zum Iba1-Promotor in der Großhirnrinde und im Striatum deutlich erhöht. Die Zugabe von miR-129-2-3p.T zu AAV9.Iba1.miR-9.T hatte keinen Einfluss auf die Transduktionseffizienz in den drei untersuchten Gehirnregionen.

Die direkte parenchymale Injektion von AAV beeinträchtigt das Mikrogefäßsystem des Gehirns, was zum Eindringen von Iba1-positiven, aus dem Blut stammenden Monozyten in das Gehirngewebe führen kann. Um zu überprüfen, ob die GFP-markierten Zellen diese infiltrierenden Monozyten enthielten, wurde AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T in das Striatum und Kleinhirn injiziert, wie in Abb. 2 dargestellt. Eine Woche danach Injektions-, Striatal- und Kleinhirnschnitte wurden dreifach immunmarkiert für GFP, Iba1 und Transmembranprotein 119 (TMEM119), einen hochspezifischen Mikroglia-Marker, der nicht von ZNS-Makrophagen, dendritischen Zellen, infiltrierenden Monozyten oder anderen Immun- oder Nervenzelltypen exprimiert wird36 (Ergänzende Abb . 7). Wir untersuchten GFP- und Iba1-doppelt-positive Zellen (n = 299 Zellen in den fünf Striatalschnitten von drei Mäusen und n = 207 Zellen in drei Kleinhirnschnitten von zwei Mäusen), die sich alle auch als positiv für TMEM119 erwiesen. Dies weist auf eine geringe oder keine Kontamination infiltrierender Monozyten in Hirngeweben hin, denen AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T injiziert wurde.

Um zu bestätigen, dass es sich bei den transduzierten Zellen nicht um Astrozyten handelte, wurden Striatal- und Kleinhirnschnitte außerdem auf gliales fibrilläres saures Protein (GFAP), einen Marker für Astrozyten, immungefärbt (ergänzende Abbildung 8). Wir haben sorgfältig nach GFP- und GFAP-doppelt-positiven Zellen (Astrozyten) gesucht (fünf Striatumschnitte von drei Mäusen und drei Kleinhirnschnitte von zwei Mäusen), konnten solche Zellen jedoch nicht finden.

Wir untersuchten das Transduktionsprofil drei Wochen nach der AAV-Injektion (Abb. 3a). Im Striatum blieb die auf Mikroglia gerichtete Transduktion mit schwacher GFP-Expression in Nicht-Mikroglia-Zellen erhalten (Abb. 3b). Über 80 % der GFP-positiven Zellen waren Iba1-positive Mikroglia (80,6 ± 1,5 %; 2061 Zellen in 2576 GFP-positiven Zellen, n = 9 Mäuse) (Abb. 3g). Im Kleinhirn verringerte sich die Spezifität für Mikroglia jedoch auf etwa 60 % (56,1 ± 5,2 %; 896 Mikroglia in 1.637 GFP-positiven Zellen, n = 7 Mäuse) (Abb. 3c, g). Da das Kleinhirn eine zehnmal höhere AAV-Dosis erhielt als das Striatum, reduzierten wir die Injektionsdosis auf ein Viertel (von 3,9 × 1010 vg/Maus auf 1,0 × 1010 vg/Maus), was zu einem signifikanten Anstieg der Mikroglia führte Spezifität auf 83 % (82,5 ± 4,9 %, 890 Zellen in 1.067 GFP-positiven Zellen, n = 7 Mäuse) (Abb. 3d, g).

ein AAV-Konstrukt (AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T) und schematische Darstellung der Virusinjektion. Mäuse, denen eine AAV-Injektion in drei Gehirnregionen mit der gleichen Dosis wie in Abb. 2 (hohe Dosis; H) oder etwa einem Viertel (niedrige Dosis; L) verabreicht wurde, wurden 3 Wochen nach der Injektion immunhistochemisch untersucht. b–f Immunhistochemie des Striatums (b), des Kleinhirns (c, d) und der Großhirnrinde (e, f). Die injizierten Dosen wurden oberhalb der Schemata beschrieben. Beachten Sie die starke und effiziente GFP-Expression in Mikroglia mit schwacher Transduktion von Iba1-negativen nicht-Mikrogliazellen im Striatum und Kleinhirn (b, c). Im Gegensatz dazu zeigte die Großhirnrinde eine GFP-Expression hauptsächlich in nicht-mikroglialen Zellen, einschließlich solchen, die eine Pyramidenneuronen-ähnliche Morphologie aufwiesen (e). Eine Senkung der Virusdosis auf ein Viertel unterdrückte die GFP-Expression in nicht-mikroglialen Zellen im Kleinhirn und in der Großhirnrinde (d, f). Maßstabsbalken; 100 μm. g Zusammenfassendes Diagramm, das die Zellspezifität für Mikroglia in den drei Gehirnregionen zeigt. Die Zahlen über dem Diagramm stellen die relativen Dosen des injizierten AAV dar, wenn die in das Striatum injizierte Dosis mit 1 angenommen wird. Box-and-Whisker-Diagramme zeigen den Median (Mittellinie), das 25. bis 75. Perzentil (Box) und die minimalen bis maximalen Werte (Whisker). ) (Striatum, n = 9 Mäuse pro Gruppe; Kleinhirn, n = 7 Mäuse pro Gruppe, zweiseitiger ungepaarter t-Test, t(12) = 3,711, **P ≤ 0,01 für hohe Dosis vs. niedrige Dosis; Großhirnrinde , n = 4 Mäuse pro Gruppe, zweiseitiger ungepaarter t-Test, t(6) = 4,513, **P ≤ 0,01 für hohe Dosis vs. niedrige Dosis).

In der Großhirnrinde führte eine dreiwöchige Inkubation zu einer umfassenden Transduktion von Nicht-Mikrogliazellen (4,0 ± 1,3 %, 29 Mikroglia in 718 GFP-positiven Zellen, n = 4 Mäuse; Abb. 3e, g), obwohl die Großhirnrinde erhielt die niedrigste AAV-Dosis. Eine weitere Senkung der Injektionsdosis auf ein Viertel (von 1,95 × 109 vg/Maus auf 0,5 × 109 vg/Maus) erhöhte die Mikroglia-Spezifität deutlich, blieb aber immer noch bei 27,3 ± 3,5 % (369 Zellen in 1316 GFP-positiven Zellen, n = 8 Mäuse; Abb. 3f, g). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Mikroglia im Striatum und Kleinhirn durch die Wahl der optimalen Injektionsdosis stabil und mit hoher Spezifität transduziert werden können; Allerdings ist es immer noch schwierig, die Transgenexpression in nicht-mikroglialen Zellen in der Großhirnrinde zu unterdrücken.

Frühere Studien haben über die Induktion der miR-9-Produktion nach der Behandlung mit Lipopolysaccharid (LPS) in Mikroglia17 und Monozyten15 berichtet. Wenn dies der Fall ist, ist AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T in LPS-aktivierten reaktiven Mikroglia möglicherweise nicht nützlich. Um diese Hypothese zu validieren, injizierten wir AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T in einer anfänglich hohen Dosis (Großhirnrinde, 1,95 × 109 vg/Maus; Striatum, 3,9 × 109 vg/Maus; Kleinhirn, 3,9 × 1010 vg/Maus) zusammen mit LPS (0,2 µg/µL) bei erwachsenen Mäusen, gefolgt von einer intraperitonealen Injektion von LPS (1 µg/g Körpergewicht) jeden Tag für eine Woche (Abb. 4a). Die Mäuse wurden für die Immunhistochemie getötet. Wir beobachteten eine robuste GFP-Expression in zahlreichen Mikroglia in allen drei Gehirnregionen (Abb. 4b – m). Transduzierte Mikroglia in LPS-behandelten Mäusen hatten eine amöboide Form mit kürzeren und dickeren Fortsätzen. Diese Ergebnisse weisen auf die wirksame Transduktion reaktiver Mikroglia sowie verzweigter Mikroglia durch AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T hin.

ein Diagramm, das das Versuchsprotokoll darstellt. Eine Lösung, die AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T und LPS (0,2 μg/μL) enthielt, wurde am Tag 0 in die drei Gehirnregionen injiziert, gefolgt von einer zusätzlichen intraperitonealen Injektion von LPS (1). μg/g Körpergewicht) täglich bis zum 7. Tag. Mäuse wurden 6 Stunden nach der LPS-Injektion am 7. Tag getötet. Hirnschnitte wurden auf GFP und Iba1 immunmarkiert. b–m Niedrige, mittlere und hohe Vergrößerung der Großhirnrinde (b–e), des Striatums (f–i) und des Kleinhirns (j–m). Quadratische Bereiche in (b), (f) und (j) wurden zu (c), (g) bzw. (k) vergrößert. Maßstabsbalken: 500 μm (b, f, j), 200 μm (c, g, k) und 20 μm (d, e, h, i, l, m). GL-Körnchenzellschicht, LPS-Lipopolysaccharid, ML-Molekülschicht.

Mikroglia erkennen die spezifische Struktur von LPS über TLR4 (Toll-like-Rezeptor 4), was zur Freisetzung entzündungsfördernder Zytokine führt, während Mikroglia in neurodegenerativen Geweben wahrscheinlich über Scavenger-Rezeptoren stimuliert werden, die die Phagozytose apoptotischer Zelltrümmer und die Freisetzung von apoptotischen Zelltrümmern induzieren entzündungshemmende Zytokine37. Daher können reaktive Mikroglia in neurodegenerativen Geweben miRNAs produzieren, die sich von denen in LPS-exponierten Mikroglia unterscheiden. Anschließend untersuchten wir, ob AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T für die Transduktion von Mikroglia in neurodegenerativen Geweben verwendet werden kann. Als neurodegeneratives Modell wählten wir transgene Mäuse (SCA1-Tg) mit spinozerebellärer Ataxie Typ 1 (SCA1), die abnormal expandiertes ATXN1 exprimieren, insbesondere in Kleinhirn-PCs unter der Kontrolle des PC-spezifischen L7-Promotors (auch als B05-Linie bekannt)38 ,39. Vierundzwanzig Wochen alte symptomatische SCA1-Tg-Mäuse und ihre Wildtyp-Wurfgeschwister erhielten Kleinhirninjektionen einer niedrigeren Dosis von AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T (1,0 × 1010 vg). /Maus; Abb. 5a).

ein AAV-Konstrukt (AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T) und schematische Darstellung der Virusinjektion. AAV (Dosis: 1,0 × 1010 vg/Maus) wurde im Alter von 24 Wochen in das Kleinhirn von Wildtyp- und SCA1-Tg-Mäusen injiziert. Drei Wochen nach der Virusinjektion wurden Kleinhirnschnitte mittels Immunhistochemie analysiert. b–d GFP-Immunfluoreszenzbild des Wildtyp-Maus-Kleinhirns (WT). z. B. GFP-Immunfluoreszenzbild eines sagittalen Abschnitts des SCA1-Tg (B05)-Maus-Kleinhirns. Quadratische Bereiche in b und e wurden auf c, d bzw. f, g vergrößert. Maßstabsbalken; 500 μm (b, e) und 20 μm (c, d, f, g). GL-Körnchenzellschicht, ML-Molekülschicht.

Drei Wochen nach der Virusinjektion wurden Kleinhirnschnitte auf GFP und Iba1 immunmarkiert. Konfokale Mikroskopie zeigte eine effiziente und spezifische Transduktion von Mikroglia in Schnitten sowohl von SCA1-Tg-Mäusen als auch von ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern (Abb. 5b – g). Bemerkenswerterweise wurde im SCA1-Tg-Maus-Kleinhirn eine viel höhere Mikroglia-Population transduziert als bei Wildtyp-Wurfgeschwistern, was zumindest teilweise auf die deutlich erhöhte Mikroglia-Dichte im Vergleich zu altersgleichen Wildtyp-Mäusen zurückzuführen ist40. Diese Ergebnisse erweitern das AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T für die gezielte Bekämpfung von Mikroglia in neurodegenerativen Geweben.

Um die dynamischen morphologischen Veränderungen in Mikroglia zu untersuchen, wurde sieben–12 Tage nach der AAV-Injektion (AAV9-Iba1-GFP-miR-9.T-miR-129-2-) eine konfokale Live-GFP-Bildgebung in der Körnerzellschicht akuter Kleinhirnschnitte durchgeführt. 3p.T; 3,9 × 1010 vg/Maus) zum Kleinhirn. Die meisten GFP-markierten Mikrogliazellen zeigten eine basale morphologische Motilität, obwohl der Grad der Motilität zwischen den Zellen variierte (Abb. 6a; Zusatzvideos 1–3). In einigen Zellen führte die Badanwendung von ATP (100 μM) mit einiger Verzögerung zu einem Anstieg der Motilität (Abb. 6b und Zusatzvideos 4 und 5). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der morphologischen Dynamik von Mikroglia41,42.

a, b Zeitraffer-GFP-Fluoreszenzbilder (Zeitangabe über den Bildern), die die Grundbewegungen der Mikrogliafortsätze in a und die ATP-induzierte Motilitätshochregulierung der Mikroglia in b zeigen (Bilder, bei denen 100 µM ATP im Bad aufgetragen wurden, sind als „angezeigt“). +ATP'; 3 Min. ATP-Anwendung im oberen Feld und 1 Minute im unteren Feld von b). Die oberen und unteren Felder in a und b entsprechen Beispielen aus verschiedenen Zellen. Maßstabsbalken: 10 µm.

Als nächstes untersuchten wir, ob unsere Mikroglia-selektive Genexpressionsmethode zur Messung des Ca2+-Signals eines genetisch kodierten fluoreszierenden Calciumindikators, G-CaMP7.0943, verwendet werden kann. Mindestens eine Woche nach der AAV-Injektion (AAV9-Iba1-G-CaMP7.09-miR-9.T-miR-129-2-3p.T; 3,9 × 1010 vg/Maus) in das Kleinhirn wurde eine konfokale Live-Ca2+-Bildgebung durchgeführt durchgeführt in der Körnerzellschicht akuter Kleinhirnscheiben. Einige Mikroglia zeigten spontane Ca2+-Aktivität (Ergänzungsvideos 6–8; vor der ATP-Anwendung und Abb. 7b; ROI 3 vor der ATP-Anwendung). Die Badanwendung von ATP (100 µM) löste zuverlässig einen Ca2+-Anstieg nicht nur in größeren Zellkompartimenten aus (Abb. 7a, vermutlich Mikroglia-Soma oder größere Mikroglia-Prozesse; Zusatzvideos 7 und 8), sondern auch in kleineren Kompartimenten (Abb. 7b, d, vermutlich). Mikroglia-Feinfortsätze; Ergänzungsvideo 7) von G-CaMP-positiven Zellen. Die mittlere Spitzenamplitude der ATP-induzierten Ca2+-Signaländerungen (∆F/Fbasal, siehe Methoden) betrug 3,36 ± 0,19 (Abb. 7c, n = 91 Zellkompartimente aus fünf Kleinhirnschnitten von zwei Mäusen). Diese Ergebnisse stimmen mit der typischen mikroglialen Ca2+-Dynamik überein, da Mikroglia purinerge Rezeptoren exprimieren und ATP-induzierte Ca2+-Reaktionen in der Größenordnung von Sekunden zeigen35,44.

a, b Die linken Felder zeigen die gemittelten konfokalen Bilder viral exprimierter G-CaMP-Signale in der Körnerzellschicht akuter Kleinhirnschnitte. Die interessierenden Regionen (ROIs 1–4) wurden auf größere Kompartimente (möglicherweise Mikroglia-Somata oder deren größere Prozesse) in a und auf kleinere Kompartimente (möglicherweise feine Mikroglia-Prozesse) der Mikroglia in b festgelegt. Die rechten Felder zeigen Spuren von Ca2+-Signaländerungen, die aus der Fluoreszenz der in den linken Feldern dargestellten ROIs geschätzt wurden. Die Badanwendung von 100 µM ATP (angezeigt in schwarzen Balken) rief starke Ca2+-Transienten sowohl in den größeren als auch in den kleineren Kompartimenten der transduzierten Mikroglia hervor. c Ein Box-and-Whisker-Diagramm, das quantifizierte Ca2+-Signale zeigt, die durch im Bad aufgetragenes ATP (∆F/Fbasal, siehe Methoden) in den mikroglialen Zellkompartimenten induziert werden. Offene Kreise kennzeichnen einzelne Datenpunkte. Die horizontale Linie und das Kästchen stellen den Medianwert bzw. den Interquartilbereich dar. Die Fehlerbalken geben eine Standardabweichung über und unter dem Mittelwert (gefüllter Kreis) an. d Zeitraffer-Fluoreszenzbilder, die die Bewegung eines Mikrogliafortsatzes zeigen, der G-CaMP7.09 exprimiert (angezeigt durch einen weißen Kreis). Beachten Sie, dass die anderen G-CaMP-positiven Mikroglia-Kompartimente außerhalb des weißen Kreises statisch waren.

Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die funktionellen Ca2+-Indikatorproteine ​​G-CaMP mit dieser Methode erfolgreich in Kleinhirn-Mikroglia exprimiert werden. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass unsere AAV-vermittelte Mikroglia-spezifische Genexpressionsmethode auch auf die Expression eines anderen Gens als GFP anwendbar ist und dass unsere Methode ein leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung der morphologischen Dynamik lebender Mikroglia sein kann.

Zelluläre microRNAs, einschließlich miR-9 und miR-129-2-3p, spielen eine entscheidende Rolle bei zellulären Funktionen wie Zellüberleben, dendritischer Verzweigung und synaptischer Plastizität45,46,47,48,49. Der Einschluss endogener miRNAs durch überexprimierte miR.T-Sequenzen in Neuronen und/oder anderen Zelltypen kann die inhärenten Rollen von miRNAs beeinträchtigen und folglich die Zellfunktionen stören. Um diese Möglichkeit zu testen, wurde mRNA, die miR-9.T und miR-129-2-3p.T enthielt, im gesamten Gehirn durch die systemische Anwendung des die Blut-Hirn-Schranke durchdringenden AAV-PHP.B, das GFP-miR-exprimiert, überexprimiert. 9.T-miR-129-2-3p.T, unter Verwendung des leistungsstarken Zytomegalievirus und Hühner-β-Actin-Hybrid (CBh)-Promotors50 (AAV-PHP.B-CBh-GFP-miR.T) oder AAV-PHP.B-Expression GFP allein unter Verwendung desselben CBh-Promotors (AAV-PHP.B-CBh-GFP; ergänzende Abbildung 9a). Da das Kleinhirn höhere Mengen an miR-9 und miR-129-2-3p exprimiert als andere Gehirnregionen wie die Großhirnrinde, der Hirnstamm und das Rückenmark51, haben wir die motorische Koordinationsfähigkeit des Kleinhirns der behandelten Mäuse mit Rotarod und getestet Beamwalking-Tests drei Wochen nach der Virusinjektion. Die Ergebnisse zeigten in keinem der Verhaltenstests einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen (t-Test, n = 5 Mäuse für jede Gruppe; ergänzende Abbildung 9b, c).

Nach den Verhaltenstests wurden die Mäuse zur histologischen Analyse getötet. Kontrollmäuse zeigten eine robuste GFP-Expression sowohl in der Leber als auch im Gehirn (n = 5 Mäuse, mittlere Felder in der ergänzenden Abbildung 9d). Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.T exprimierten, trotz starker GFP-Expression in der Leber fast keine GFP-Expression im Gehirn (n = 6 Mäuse; untere Felder in der ergänzenden Abbildung). 9d). Sagittale Schnitte des Gehirns bestätigten eine weitgehende Unterdrückung der GFP-Expression im gesamten Gehirn durch die Koexpression von miR-9.T-miR-129-2-3p.T (oberes rechtes Feld in ergänzender Abbildung 9e). Vergrößerte Bilder zeigen eine schwache GFP-Expression in einer kleinen Anzahl von Zellen, einschließlich Gefäßendothelzellen und Kleinhirn-PCs (mittlere und untere rechte Tafel in ergänzender Abbildung 9e).

Endogene miRNAs, die an miR-Zielsequenzen gebunden sind, können zusammen mit viralen mRNAs abgebaut werden. Um dies zu untersuchen, verglichen wir die Konzentrationen von endogenem miR-9, miR-129-2-3p und miR-129-5p (als Kontrolle) in Mäusen, die GFP-miR-9 exprimieren.T-miR-129-2- 3p.T und solche, die GFP allein in drei Hirngeweben (Großhirnrinde, Striatum und Kleinhirn) exprimieren. Die Ergebnisse zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede in den miR-9-, miR-129-2-3p- und miR-129-5p-Spiegeln zwischen den beiden Gruppen in allen drei Gehirnregionen (t-Test, n = 5 Mäuse pro Gruppe, ergänzende Abb . 9f).

Um den Einfluss der Überexpression von miR.T auf die neuronale Funktion zu überprüfen, untersuchten wir die elektrophysiologischen Eigenschaften des Kleinhirns bei mit AAV-PHP.B behandelten Mäusen, die GFP allein oder in Kombination mit miR.T (miR-9.T und miR-129) exprimierten -2-3p.T).

Die Mäuse wurden 3 Wochen nach der Virusinjektion getötet. Bei starker Vergrößerung von Kleinhirnschnitten von Mäusen, die GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.T exprimierten, stellten wir fest, dass die PCs schwach mit GFP markiert waren (unteres Feld, ergänzende Abbildung 10a). Dies kann daran liegen, dass die durch den CBh-Promotor gesteuerte GFP-miR-Target-Expression stark genug ist, um die Kapazität der miR-vermittelten Gen-Stummschaltung zu überschreiten. In dieser Studie haben wir elektrophysiologisch untersucht, ob GFP-miR.T-positive PCs im Vergleich zu Kontroll-PCs, die GFP allein (ohne miR.T) unter der Kontrolle desselben Promotors exprimieren, funktionelle Anomalien aufwiesen (oberes Feld, ergänzende Abbildung 10a).

Die passiven elektrischen Membraneigenschaften von GFP-miR.T-positiven PCs (GFP-miRs.T-PCs) ähnelten denen von GFP-positiven PCs (Kontroll-GFP-PCs; ergänzende Abbildung 10b, links, Membrankapazität, Kontroll-GFP-PCs, 591,6 ± 45,1 pF, n = 18; GFP-miR.T-PCs, 655,6 ± 56,5 pF, n = 14, t-Test, P = 0,377; Ergänzende Abbildung 10b, rechts, Eingangswiderstand, Kontroll-GFP-PCs, 155,2 ± 38,6 MΩ, n = 18, GFP-miR.T PCs, 139,7 ± 24,8 MΩ, n = 14, t-Test, P = 0,755). Wir untersuchten spontane Feuerungsmuster von Aktionspotentialen (Spikes) in PCs durch extrazelluläre Loose-Patch-Aufzeichnung (ergänzende Abbildung 10c, links), und es gab keinen Unterschied in den Intervallen spontaner neuronaler Spike-Aktivitäten (d. h. spontane Feuerungsrate) zwischen GFP- miR.T-PCs und Kontroll-GFP-PCs (Ergänzende Abbildung 10c rechts, Kontroll-GFP-PCs, 43,1 ± 6,6 ms, n = 20; GFP-miR.T-PCs, 34,7 ± 5,8 ms, n = 15, t-Test, P = 0,369). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die übermäßige Expression von miR.T keinen Einfluss auf die intrinsischen Feuereigenschaften von Kleinhirn-PCs hat.

Wir untersuchten auch die synaptische Übertragung von Parallelfasern (PFs) zu GFP-miR.T-PCs. Basale erregende synaptische Reaktionen an PF-PC-Synapsen wurden durch die Aufzeichnung von Alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-i-säure (AMPA)-Rezeptor-vermittelten erregenden postsynaptischen Strömen (EPSCs) als Reaktion auf verschiedene Reizintensitäten charakterisiert, die auf die Synapsen angewendet wurden PFs (Ergänzende Abbildung 10d, links). Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Beziehung zwischen Reizintensität und EPSC-Amplitude zwischen den GFP-miR.T-PCs und den Kontroll-GFP-PCs (ergänzende Abbildung 10d, rechts; mehrere t-Tests korrigiert mit der Holm-Sidak-Methode, P > 0,89 bei alle Intensitäten). Die kurzfristige synaptische Plastizität an den PF-PC-Synapsen wurde mithilfe von Stimulationsprotokollen mit gepaarten Impulsen mit unterschiedlichen Intervallen (10 ms bis 5 s) zwischen dem ersten und zweiten Impuls untersucht (ergänzende Abbildung 10e, links). Die Amplitude des durch ein Impulspaar hervorgerufenen zweiten PF-EPSC wurde auf die des ersten PF-EPSC normalisiert, und das Verhältnis (dh das Verhältnis der gepaarten Impulse) wurde gegen die Intervalle zwischen den Reizen aufgetragen (ergänzende Abbildung 10e, rechts). Sowohl GFP-miR.T-PCs als auch Kontroll-GFP-PCs zeigten in kürzeren Abständen eine ähnliche synaptische Erleichterung (ergänzende Abbildung 10e), was typisch für PF-PC-Synapsen ist, und es gab keinen statistischen Unterschied in den Paarimpulsverhältnissen zwischen GFP-miR . T-PCs und Kontroll-GFP-PCs (Zweiwege-ANOVA mit wiederholten Messungen, miR-Effekt, P = 0,35). Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Überexpression von miR.T keinen Einfluss auf die basale synaptische Übertragung oder die kurzfristige synaptische Plastizität an den PF-PC-Synapsen hat.

Als nächstes untersuchten wir, ob die systemische Anwendung von AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T die Mikroglia im Gehirn erfolgreich transduzierte. Wildtyp- (WT) und SCA1-Tg-Mäuse erhielten im Alter von 36 Wochen eine intravenöse Infusion von AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T (1,5 × 1012 vg/ Maus) und wurden 3 Wochen nach der Injektion für die Immunhistochemie getötet (Abb. 8a). Konfokale Mikroskopie zeigte, dass GFP-Punkte im gesamten Gehirn verstreut waren, einschließlich des Kleinhirns und der Brückenkerne (WT- und SCA1-Tg-Mäuse, Abb. 8b und ergänzende Abb. 11).

SCA1-Tg-Mäuse im Alter von 36 Wochen erhielten eine intravenöse Infusion von AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T (Dosis: 1,5 × 1012 vg/Maus). Drei Wochen nach der Virusinjektion wurden Gehirnschnitte hergestellt und durch doppelte Immunmarkierung auf GFP und Iba1 analysiert. (bd) Immunfluoreszenzbilder eines Sagittalschnitts (Läppchen II und III) der SCA1-Tg-Maus (b) und die Vergrößerung quadratischer Bereiche (c, d). Beachten Sie die Aggregation von GFP in Mikroglia im SCA1-Tg-Maus-Kleinhirn. Maßstabsbalken, 20 μm. GL; Körnerzellschicht, iv; intravenöse Injektion, ML; molekulare Schicht, SCA1-Tg; Spinozerebelläre Ataxie Typ 1 – transgen.

Bei höherer Vergrößerung stellten wir fest, dass sich die GFP-Punkte in Iba1-immunmarkierten Mikroglia befanden (Abb. 8c, d und ergänzende Abb. 11d, e, g, h). Wir vermuteten, dass dies der lysosomale Abbauprozess des GFP-Proteins in Mikroglia war. Um dies zu überprüfen, wurden Kleinhirnschnitte auf GFP, Iba1, Kern-DNA (unter Verwendung der Hoechst-Färbung) und lysosomal-assoziiertes Membranprotein 1 (LAMP1), ein Glykoprotein, das sich über lysosomale Membranen befindet, immunmarkiert53. Wie angenommen, waren GFP-Aggregate genau zusammen mit der LAMP1-Immunreaktivität lokalisiert (ergänzende Abbildung 12), was darauf hinweist, dass GFP-Aggregate in Mikroglia-Lysosomen vorhanden waren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die intravenöse Verabreichung von AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T eine GFP-Expression speziell in Mikroglia verursacht. Im Gegensatz zur direkten Injektion in Hirngewebe wird GFP jedoch in einen lysosomalen Verdauungsweg einsortiert.

Es gelang uns, eine mikrogliaspezifische Transduktion in bestimmten Gehirnregionen erwachsener Mäuse durch direkte Injektion von AAV-Vektoren in das Gehirnparenchym zu erreichen, die den 1,7-kb-Maus-Iba1-Promotor und zwei Sätze von 4-Tandem-Sequenzkopien tragen, von denen jede zu verschiedenen miRNAs, miR, komplementär ist -9 und miR-129-2-3p.

Das Vorhandensein oder Fehlen sowie das Ausmaß der endogenen Genexpression werden entwicklungsstadiumabhängig und zelltypspezifisch streng reguliert. Im Gegensatz dazu wird die AAV-vermittelte Transgenexpression unter Verwendung eines zelltypspezifischen Promotors weniger von dieser biologischen Regulation beeinflusst, da der Einbau des zelltypspezifischen Promotors, der sich nur auf eine begrenzte Genomregion erstreckt, unzureichend ist und die Anwendung einer Überdosis möglich ist, was zu einer ektopischen Transgenexpression führt in unbeabsichtigten Zelltypen. In diesem Zusammenhang ist die Injektion einer optimalen AAV-Dosis, die einen Promotor mit hoher Spezifität für Mikroglia trägt, für das Mikroglia-Targeting von entscheidender Bedeutung. Unter unseren experimentellen Bedingungen (Abb. 1b, f) wirkte der vorliegende 1,7-kb-Maus-Iba1-Promotor bevorzugt in Mikroglia im Striatum (~ 69 %) und im Kleinhirn (~ 86 %), wohingegen er nahezu keine Spezifität für Mikroglia im Striatum zeigte Großhirnrinde (~ 2 %), unabhängig von der niedrigsten Dosisanwendung (Tabelle 1 und ergänzende Abbildung 3), was auf Heterogenität des Gehirngewebes und Regionsspezifität des 1,7-kb-Iba1-Promotors hindeutet. Ein weiterer Nachteil der Verwendung viraler Vektoren ist die begrenzte Verpackungskapazität, insbesondere bei AAV; Die relativ lange Größe des Iba1-Promotors (1,7 kb) beschränkt die Größe des Transgens auf maximal ~2 kb.

Obwohl wir den Iba1-Promotor für die auf Mikroglia gerichtete Transgenexpression genutzt haben, sollte beachtet werden, dass der Iba1-Promotor genau ein myeloischer zellspezifischer Promotor ist und in residenten ZNS-Makrophagen, einschließlich meningealer, perivaskulärer und Aderhautplexus-Makrophagen, wirkt. dendritische Zellen; und infiltrierende Monozyten unter pathologischen Bedingungen. Daher kann eine subtile Population von Zellen, die mit AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T transduziert wurden, diese Zelltypen umfassen.

MicroRNAs leiten Argonaute (AGO)-Proteine ​​und bilden das Targeting-Modul des miRNA-induzierten Silencing-Komplexes (miRISC), der eine translationale Unterdrückung und einen Abbau der gezielten mRNAs verursacht54. Es wurde gezeigt, dass sowohl miR-9 als auch miR-129-2-3p in Nicht-Mikrogliazellen angereichert sind, in Mikrogliazellen jedoch spezifisch vermindert sind22. Somit werden mRNAs, die die Zielsequenzen tragen, von miRISCs, die miR-9 oder miR-129-2-3p enthalten, geschwämmt, was zur selektiven Unterdrückung der Transgenexpression in nicht-mikroglialen Zellen führt. Ein Problem ist der gleichzeitige Abbau von miRNAs und deren Erschöpfung in Nicht-Mikrogliazellen, einschließlich Neuronen. Allerdings veränderten sich die endogenen miR-9- und miR-129-2-3p-Spiegel in den drei Gehirnregionen nicht signifikant, selbst nach Überexpression von GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.T unter Verwendung eines starken und allgegenwärtiger CBh-Promotor (ergänzende Abb. 9f), obwohl die GFP-Expression drastisch unterdrückt wurde (ergänzende Abb. 9d, e). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit einem kürzlich veröffentlichten Bericht55, der zeigt, dass vollständig komplementäre Ziele (wie in unserem vorliegenden Fall) gespalten werden, wenn sie an eine katalytische AGO wie Säugetier-Ago2 gebunden werden, die Paarung der Ziel-mRNA mit AGO jedoch zur Entladung der miRNA führt von AGO und Recycling der miRNA. In Übereinstimmung damit waren die motorischen Fähigkeiten und Patch-Clamp-Analysen des Kleinhirns bei den Mäusen, die GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.T im gesamten Gehirn exprimierten, nicht signifikant verändert (ergänzende Abbildungen 9 und 10). . Dennoch können eine Beeinträchtigung der neuronalen Funktion in anderen Hirnregionen und ein Zusammenhang mit Verhaltensstörungen bei Überexpression von miR-9.T und miR-129-2-3p.T nicht ausgeschlossen werden.

Im Gegensatz zu miR-129-2-3p.T konnte die Zugabe von miR-136-5p.T zu AAV9.Iba1.miR-9.T trotz der Expression von miR-136 die Transgenexpression in nicht-miR-136-Zellen nicht unterdrücken -5p in Neuronen21. Eine frühere Studie zeigte, dass unreife dendritische Zellen, die niedrige miR-155-Spiegel exprimierten, die Expression eines miR-155T-tragenden Transgens nicht unterdrückten, wohingegen reife dendritische Zellen, die die miR-155-Spiegel hochregulierten, eine auffällige Zielunterdrückung induzierten32, was darauf hindeutet, dass die Zielherunterregulierung bei a erfolgt bestimmte Schwelle der miRNA-Expression. Diese Annahme wird durch einen aktuellen Bericht gestützt, der ergab, dass die Expressionsniveaus von miR-136-5p in der Großhirnrinde weitaus niedriger waren als die von miR-129-2-3p (und miR-9)51. Daher liegen die Expressionsniveaus von miR-136-5p in Nicht-Mikrogliazellen wahrscheinlich unter dem Schwellenwert für den Abbau der Ziel-mRNA.

Zusätzlich zu verzweigten Mikroglia in gesunden Geweben transduzierten AAV-Vektoren reaktive Mikroglia im Gehirn von LPS-behandelten und SCA1-Tg-Mäusen. Dies könnte von Vorteil sein, da unsere Methode auf pathologische und präklinische Experimente angewendet werden kann, die auf Neuroinflammation und Neurodegeneration abzielen, wie zuvor in Mäusemodellen für die Parkinson-Krankheit beschrieben56. Darüber hinaus könnte AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T für Funktionsstudien von Mikroglia verwendet werden, wie die G-CaMP7.09-basierte Überwachung der intrazellulären Ca2+-Mobilisierung zeigt (Abb. 7).

Die intravenöse Anwendung von AAV-PHP.B, das auf Mikroglia abzielt, führte zu einer mikrogliaspezifischen GFP-Expression. Allerdings wurde das exprimierte GFP unerwartet auf den lysosomalen Abbauweg übertragen. Da Mikroglia eine Rolle bei der Bekämpfung von Viren spielen, die aus der peripheren Zirkulation in das Gehirn gelangen, kann das AAV-Kapsid beim Durchqueren der Blut-Hirn-Schranke einige Modifikationen erfahren, wie z. Dieses Ergebnis ist für uns enttäuschend, könnte aber ein Teilerfolg bei der intravenösen Verabreichung eines Transgenprodukts speziell an Mikroglia sein. Darüber hinaus könnte die Erforschung des Mechanismus, der der Mikroglia-Aktivierung durch BHS-gekreuzte AAV (jedoch nicht durch direkt in Gehirngewebe injiziertes AAV) zugrunde liegt, zur Identifizierung einer Schlüsselinteraktion (oder eines Schlüsselmoleküls) führen, die residente Mikroglia sensibilisiert, was wahrscheinlich die Entwicklung einer Mutante erleichtert Kapsid, das Mikroglia nicht sensibilisiert.

Insgesamt bestätigten unsere Ergebnisse die Wirksamkeit der direkten Gehirninjektion von AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T für die Transduktion reaktiver Mikroglia in einer pathologischen Umgebung sowie verzweigter Mikroglia in gesunden Gehirnen . Obwohl Mikroglia, die auf die Großhirnrinde abzielen, eine sorgfältige Anpassung der Verabreichungsdosis und der Inkubationszeit erfordern, wäre AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T für Grundlagenforschung und präklinische Studien nützlich und könnte dies auch sein vielversprechend in klinischen Studien, die auf Mikroglia abzielen, da Sequenzen von miR-9 und miR-129-2-3p von Nagetieren bis zu Primaten, einschließlich Homo sapiens, weit verbreitet sind.

Während der Erstellung dieses Manuskripts wurde über AAV-Kapsidvarianten mit hoher Affinität zu Mikroglia berichtet; Sie waren jedoch nicht spezifisch für Mikroglia57. Die Kombination dieser mikrogliatropen mutierten Kapside mit unserem auf Mikroglia gerichteten Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T kann dazu beitragen, die Anwendungsdosis erheblich zu reduzieren und ein höheres Mikroglia-Targeting in der Großhirnrinde zu erreichen.

Zielsequenzen wurden auf der Grundlage von miRNA-Sequenzen entworfen, die aus dem miRNA-Register (www.mirbase.org) stammen. Die für die Konstruktion von miR.Ts verwendeten Oligonukleotide sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Für den PGK.miR-9.T-Vektor sind die entsprechenden Sense 1 (S1), Sense 2 (S2), Antisense 1 (AS1) und Antisense 2 ( AS2)-Oligonukleotide wurden angelagert und in die KpnI- und BamHI-Restriktionsstellen im 3'-UTR der Transgen-Expressionskassette des Eltern-AAV.PGK-Vektors ligiert. Für die Vektoren PGK.miR-9.T.miR-129-2-3p.T oder PGK.miR-9.T.miR-136-5p.T und S1, S2, S3, S4, AS1, AS2, AS3 und AS4-Oligonukleotide wurden angelagert und in die KpnI- und BamHI-Restriktionsstellen im 3'-UTR der GFP-Expressionskassette des Eltern-AAV.PGK-Vektors ligiert.

Wir verwendeten ein 1.678-bp-Fragment aus der 5'-flankierenden Region des ersten ATG in Exon 1 des Maus-Iba1-Gens (Aif1). Um den Iba1-Promotor zu klonen, wurde eine verschachtelte PCR mit der genomischen DNA durchgeführt, die aus Gehirnzellen von Mäusen stammt. Die Primersätze Iba1-Nest-F (5′-CCTAGAGCCATCTTGTAAGG-3′) und Iba1-Nest-R (5′-CGAGGAATTGCTGTTGAG-3′) wurden für die erste Amplifikation von DNA und Iba1-F (5′-ATGCTCTAGActcgagTACTATAGGATGCATCGTGAAAACC-) verwendet. 3′) und Iba1-R (5′-CATGGTGGCGaccggtGGCTCCTCAGACGCTGGTTG-3′) für den zweiten.

Für die Konstruktion von Iba1, Iba1.miR-9.T, Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T (Addgene ID: 190163) oder Iba1.miR-9.T.miR-136 -5p.T wurde der PGK-Promotor in den entsprechenden Eltern-AAV.PGK-Vektoren an den XhoI- und AgeI-Restriktionsstellen durch den 1,7 kb großen Iba1-Promotor der Maus ersetzt.

AAV2/9- und AAV-PHP.B-Vektoren wurden durch Cotransfektion von HEK293T-Zellen (HCL4517; Thermo Fisher Scientific, Tokio, Japan) mit drei Plasmiden hergestellt: dem Expressionsplasmid pHelper (Stratagene, La Jolla, CA, USA), und pAAV9. Die Viruspartikel wurden mittels Ammoniumsulfat- oder Polyethylenglykol-8000-Fällung und kontinuierlicher Iodixanol-Gradientenzentrifugation wie zuvor beschrieben58 gereinigt. Die genomischen Titer der gereinigten AAV-Vektoren wurden durch quantitative Echtzeit-PCR unter Verwendung von Power SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher) mit den Primern 5'-CTGTTGGGCACTGACAATTC-3' und 5'-GAAGGGACGTAGCAGAAGGA-3' bestimmt, die auf die WPRE-Sequenz abzielten. Als Standards wurden Expressionsplasmidvektoren verwendet. Der Titer der konzentrierten Vektorexpression lag im Bereich von 6,92 × 1012 bis 6,30 × 1013 vg/ml.

In dieser Studie wurden C57BL/6J-Mäuse (4–8 Wochen alt), FVB/N-Tg (Pcp2-ATXN1*82Q) 5Horr-Mäuse und ihre Wildtyp-Wurfgeschwister (24–36 Wochen alt) verwendet. Bei allen Experimenten wurde sorgfältig auf das Geschlecht der Mäuse geachtet, um eine Tendenz zu Männchen oder Weibchen zu vermeiden. Alle Tierversuche wurden gemäß den Protokollen durchgeführt, die durch das japanische Gesetz zum Wohlergehen und Management von Tieren genehmigt wurden, sowie gemäß den Richtlinien für die ordnungsgemäße Durchführung von Tierversuchen, die vom japanischen Wissenschaftsrat herausgegeben wurden. Das Versuchsprotokoll wurde vom Institutionellen Komitee der Universität Gunma genehmigt (Nr. 21–063 und 21–065). Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leid zu minimieren und die Anzahl der verwendeten Tiere zu reduzieren.

Stereotaktische Injektionen von AAV-Vektoren wurden an 4 Wochen alten C57BL/6J-Mäusen, 24 Wochen alten symptomatischen FVB/N-Tg-Mäusen und ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern durchgeführt. Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht [KG]) bzw. Xylazin (10 mg/kg KG) anästhesiert. Die Narkosetiefe wurde während der gesamten Operation mithilfe des Zehenklemmreflexes überwacht und bei Bedarf wurden zusätzlich Ketamin und Xylazin injiziert. Über der Injektionsstelle wurde ein Bohrloch angebracht, um das Gehirn freizulegen. Ein AAV-Vektor (AAV9.PGK.miR-9.T, AAV9.Iba1, AAV9.Iba1.miR-9.T, AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T oder AAV9 .Iba1.miR-9.T.miR-136-5p.T) wurde in die Großhirnrinde, das Striatum und das Kleinhirn von Mäusen injiziert. Um das Impfvolumen zu reduzieren und die Präzision zu erhöhen, wurde für die Injektionen eine 10-μL-Hamilton-Spritze mit einer 33-G-Nadel verwendet. Die folgenden stereotaktischen Koordinaten wurden für die Virusinjektion verwendet: Großhirnrinde, AP –1,0 mm, ML +1,5 mm, DV +0,9 mm; Striatum, AP −1,0 mm, ML +1,75 mm, DV +2,75 mm; Kleinhirn, AP +6,5 mm, ML 0 mm, DV 2,0 mm (alle Werte beziehen sich auf das Bregma). Die Gesamtmenge der AAV-Lösung war wie folgt: Großhirnrinde, 1,95 × 109 vg/Maus; Striatum, 3,9 × 109 vg/Maus; Kleinhirn, 3,9 × 1010 vg/Maus für Hochdosis-Injektion; Großhirnrinde, 5,0 × 108 vg/Maus; Kleinhirn, 1,0 × 1010 vg/Maus zur niedrig dosierten Injektion. Die Anwendungsgeschwindigkeiten waren wie folgt: Großhirnrinde: 10 nL/min; Striatum, 20 nL/min; und Kleinhirn, 200 nL/min.

Eine intravenöse Injektion von AAV-PHP.B wurde an 36 Wochen alten symptomatischen FVB/N-Tg-Mäusen und ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern durchgeführt. Nach tiefer Anästhesie wurden 100 μl AAV-PHP.B-Lösung (1,5 × 1013 vg/ml) mithilfe einer 0,5-ml-Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel (08277; Nipro, Osaka, Japan).

Mäuse wurden transkardial mit 4 % Paraformaldehyd in 0,1 M PB (pH 7,4) perfundiert, das Gehirn wurde 6–8 Stunden nachfixiert und auf 1x PBS übertragen. Die Gehirne wurden mit einem Mikrotom (VT1000S oder VT1200S; Leica, Wetzlar, Deutschland) in koronale 50-µm-Scheiben für die Großhirnrinde, das Striatum und sagittale Schnitte des Kleinhirns geschnitten. Die Schnitte wurden 1 Stunde lang mit einer Blockierungslösung (5 % normales Eselsserum, 0,5 % Triton X-100 und 0,05 % NaN3 in PBS) behandelt und über Nacht bei 4 °C mit den in der Ergänzungstabelle 2 zusammengefassten Primärantikörpern inkubiert. Nach dem Waschen Mit PBS dreimal für jeweils 15 Minuten wurden die Schnitte 2 Stunden bis über Nacht bei 4 ° C mit den in der Ergänzungstabelle 2 zusammengefassten Sekundärantikörpern inkubiert. Schließlich wurden die Schnitte dreimal in PBS gespült und mit Hoechst 33342-Nukleinsäurefärbung (Invitrogen) inkubiert Katalognummer H1399), in ddH2O gewaschen, in ProLong Diamond/Glass Antifade Mountant (Thermo Fisher) montiert und bei 4 °C im Dunkeln gelagert. Die Immunfluoreszenz wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Zeiss LSM 800 und zugehöriger Software (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) analysiert.

Der Anteil der mit AAV-Vektoren transduzierten myeloischen Gehirnzellen wurde durch Immunhistochemie untersucht. Die 50 μm dicken Gewebeschnitte aus der Großhirnrinde, dem Striatum und dem Kleinhirn wurden auf GFP und Iba1 immungefärbt. Dreißig aufeinanderfolgende optische Schnitte in Abständen von 0,5 μm (25.513,67 μm2, Gesamttiefe 15 μm) wurden mit einem Zeiss LSM 800-Mikroskop mit einem 40x/0,95 NA-Objektiv aufgenommen und die Bilder anschließend mit der Zeiss Zen-Software verarbeitet, um eine Projektion mit maximaler Intensität zu erstellen ( MIP-Bild. Von jedem Hirnschnitt wurden 32 MIP-Bilder ohne Überlappung aufgenommen (insgesamt 816.386,42 μm2) und die Anzahl der GFP-exprimierenden myeloischen Zellen wurde gezählt. Mit Iba1 co-markierte GFP-positive Zellen wurden als myeloische Zellen des Gehirns angesehen. Es wurden drei Gehirnschnitte pro Maus und 4–9 Mäusen analysiert. Es wurden mindestens 500 Zellen gezählt.

Die konfokale Ca2+- oder GFP-Bildgebung akuter Kleinhirnschnitte wurde mit einigen Modifikationen wie zuvor beschrieben27,39 durchgeführt. Parasagittale Schnitte (200–250 µm dick) des Kleinhirnwurms wurden mit einem Vibroslicer (VT1200S; Leica, Deutschland) hergestellt und in einer Lösung (ACSF) gehalten, die (in mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1, 0 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3 und 20 d-Glucose und mit 95 % O2 und 5 % CO2 bei Raumtemperatur für mehr als 1 Stunde vor Beginn der Aufzeichnungen durchgeperlt. Die Bildverarbeitung und -analyse wurde mit Andor iQ2 (Andor), NIH ImageJ, Igor Pro8 (WaveMetrics) und maßgeschneiderten Programmen von NH durchgeführt.

G-CaMP7.09 ist ein kürzlich entwickelter genkodierter Ca2+-Indikator, der seine Fluoreszenz erhöht, wenn die intrazelluläre Ca2+-Konzentration erhöht ist43. Um Ca2+-Signale von G-CaMP7.09-exprimierenden Zellen aufzuzeichnen, wurden alle 2 s konfokale Fluoreszenzbilder (200–300 ms Belichtungszeit, 512 × 512 Pixel, kein Binning) mit einem ×40-Wasserimmersionsobjektiv (LUMPLFLN 40XW; Olympus) aufgenommen , Tokio, Japan), eine wassergekühlte CCD-Kamera (iXon3 DU-897E-CS0-#BV-500; Andor, Belfast, Nordirland) und eine Hochgeschwindigkeits-Spinning-Disk-Konfokaleinheit (CSU-X1; Yokogawa Electric). , Tokio, Japan), befestigt an einem aufrechten Mikroskop (BX51WI; Olympus, Tokio, Japan). Zur Anregung wurde ein 488-nm-Lichtstrahl von einem Diodenlasermodul (Stradus 488-50; VORTRAN, Sacramento, CA) verwendet, und die emittierte Fluoreszenz wurde durch einen Bandpassfilter (500–550 nm) gesammelt. Während der Aufzeichnungen wurden Kleinhirnscheiben mit einer ACSF-Badlösung bei Raumtemperatur perfundiert.

Um einen intrazellulären Ca2+-Anstieg in Mikroglia hervorzurufen, wurden 100 µM ATP, gelöst in der ACSF-Badlösung, extrazellulär über ein schwerkraftgespeistes Badapplikationsgerät aufgetragen44.

Da einzelne kontinuierliche Aufnahmen länger als 10 Minuten dauerten, wurde gelegentlich eine Bilddrift (Translationsdrift) beobachtet. In diesen Fällen wurden verschobene Bilder mithilfe des Image Stabilizer-Plugins in ImageJ (http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html) korrigiert. Die G-CaMP-Fluoreszenz zum Zeitpunkt t (Ft) in jedem Pixel wurde vom Hintergrund abgezogen, und der Ca2+-abhängige relative Anstieg der Fluoreszenz wurde durch Berechnung von ΔF/Fbasal gemessen, wobei Fbasal die basale Fluoreszenzintensität ist, die während der Frames vor dem Stimulus gemittelt wurde (d. h , Frames vor der ATP-Anwendung) und ΔF = Ft−Fbasal. Hintergrundfluoreszenz wurde von einem Bereich erhalten, dem die Zellstruktur im gleichen Rahmen fehlte. Die mittleren ΔF/Fbasal-Werte in jeder Region of Interest (ROI) wurden für jeden Frame berechnet. ROIs wurden auf G-CaMP-positiven Zellstrukturen platziert. Wir konnten nicht feststellen, ob sich mehrere benachbarte ROIs in einem Frame in derselben Zelle oder in anderen verschiedenen Zellen befanden. Daher haben wir einen einzelnen ROI als mikrogliales Zellkompartiment bezeichnet. Normalerweise reicht die Abdeckung eines Mikroglia-Prozessgebiets bis auf wenige hundert Mikrometer42, und die Ca2+-Bildgebungsdaten in dieser Studie wurden aus 12 verschiedenen Sichtfeldern mit einem Abstand von mehr als 300 µm in fünf Schnitten von zwei Mäusen gesammelt. Daher können wir mit Sicherheit sagen, dass unser Ca2+-Bildgebungsdatensatz von mehr als 12 Mikroglia stammt. Um ATP-induzierte Ca2+-Signale in G-CaMP-positiven Zellen zu quantifizieren, wurde die Spitzenamplitude von ΔF/Fbasal in einem Zeitfenster von 120 s nach Beginn der ATP-Anwendung gemessen.

Um die morphologische Dynamik in GFP-positiven Zellen live aufzuzeichnen, wurden alle 2–6 s konfokale GFP-Fluoreszenzbilder aufgenommen (200–250 ms Belichtung, 512 × 512 Pixel, kein Binning). Das Signal-Rausch-Verhältnis von GFP-Signalen war unter unseren Versuchsbedingungen viel höher als das von G-CaMP-Signalen. Die Bilddrift bei der GFP-Bildgebung wurde vergleichbar mit der bei der Ca2+-Bildgebung korrigiert.

Um zu untersuchen, ob der Verhaltensphänotyp durch die Überexpression von miRNA-Zielsequenzen beeinflusst wurde, wurde 6 bis 7 Wochen alten C57BL/6J-Mäusen intravenös AAV-PHP.B.CBh-GFP (PHP.B.CBh-GFP) injiziert. oder AAV-PHP.B.CBh-GFP-miR-9.T.miR-129-2-3p.T (PHP.B.CBh-GFP-miR.T), jeweils bei einem Titer von 6 × 1011 vg. Drei Wochen später wurde die motorische Leistung mithilfe des Rotarod-Tests auf einem Laufband (MK-610A/RKZ; Muromachi Kikai, Tokio, Japan) bewertet. Die Mäuse wurden drei Versuchen im Abstand von 30 Minuten unterzogen. Die Rotationsgeschwindigkeit wurde in 300 s von 4 auf 50 U/min beschleunigt und die Zeit bis zum Abfallen vom Stab gemessen. Nach dem Rotarod-Test wurden die Mäuse mit einem Beam-Walking-Test weiter getestet. Nach der Gewöhnung wurden die Mäuse auf eine Kante einer Stange (600 mm lang und 11 mm Durchmesser) gesetzt und dreimal auf der Stange gelaufen. Die Leistung der Mäuse, die auf dem Balken gingen, wurde mit einer digitalen Videokamera aufgezeichnet (Verschlusszeit: 1/500, 60 fps; HC-VX985M; Panasonic, Osaka, Japan) und die durchschnittliche Zeit, die die Mäuse zum Gehen durch einen 600- Es wurde ein mm langer Balken gemessen.

Um die Anzahl der endogenen miRNAs zu messen, wurde 8 Wochen alten C57BL/6J-Mäusen entweder PHP.B.CBh-GFP oder PHP.B.CBh-GFP-miR intravenös injiziert. T, bei einem Titer von 6 × 1011 vg/Maus. Drei Wochen nach der Injektion wurden die Mäuse tief betäubt und mit kaltem PBS (-) perfundiert. Anschließend wurden die Gehirne schnell entnommen und in zwei Teile geteilt, wobei die Links-Rechts-Achse entlang der Mittellinie lag. Die linken Gehirne (zur histologischen Beobachtung) wurden über Nacht bei 4 °C in kaltes 4 % Paraformaldehyd (PFA) getaucht und am nächsten Tag durch 4 % PFA mit 1 × PBS (-) ersetzt. Anschließend wurden sagittale Schnitte (50 μm Dicke) mit einem Mikrotom VT1200S (Leica) erstellt. Die Schnitte wurden mit Anti-GFP- (04404-84; Nacalai Tesque) und Anti-NeuN-Antikörpern (MAB377; Merck) fluoreszierend immungefärbt und unter Verwendung von ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific) montiert. Mikrofotografien von immungefärbten Schnitten wurden mit einem BZ-X800-Fluoreszenzmikroskop (Keyence) erstellt. Zur Messung der miRNA-Spiegel wurde die rechte Gehirnhälfte verwendet. Die Parietallappen der Großhirnrinde, des Kleinhirns und des Striatums wurden gesammelt und unter Verwendung des TRIzol-Reagenzes (Thermo Fisher Scientific) getrennt platziert. Das Gewebe wurde mit BioMasher II (320103; Nippi, Tokio, Japan) und Power Masher II (891300; Nippi) homogenisiert und schnell mit flüssigem Stickstoff gequencht. Die Gewebe wurden bei –80 °C gelagert, bis die RNA gesammelt wurde. Das miRNeasy Mini Kit (217004; QIAGEN, Hilden, Deutschland) wurde verwendet, um Gesamt-RNAs zu sammeln, die die miRNAs enthalten. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (4366596; Thermo Fisher Scientific) und miRNA-spezifischer Reverse-Transkriptionsprimer (Assay ID: 000583; 4427975; Thermo Fisher Scientific) revers transkribiert. Die Mengen an miR-9, miR-129-2-3p und miR-129-5p in den revers transkribierten miRNA-Proben wurden mit einer TaqMan-Sonde (Assay-ID:000583; 4427975; Thermo Fisher Scientific) und TaqMan Fast Advanced quantifiziert Master Mix (4444556; Thermo Fisher Scientific) in einem Thermocycler für Echtzeit-PCR (Thermal Cycler Dice Real-Time System II, Takara Bio, Kusatsu, Japan).

Akute Kleinhirnscheiben wurden wie im Abschnitt „Methoden“ zu „Konfokale Live-Bildgebung“ unten beschrieben vorbereitet und aufbewahrt. Ganzzellige Patch-Clamp-Aufzeichnungen wurden mit einem MultiClamp 700 B-Verstärker (Molecular Devices, USA) im Spannungsklemmenmodus (Haltepotential von -70 mV) bei Raumtemperatur aus den Somata von Kleinhirn-PCs unter Verwendung von Patch-Pipetten durchgeführt (1–4). MΩ) aus Borosilikatglas (Harvard Apparatus) oder #0010-Glas (PG10165-4, World Precision Instruments). Die Pipettenlösung enthielt (135 mM) 135 K-Gluconat, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 5 mM NaCl, 5 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP, 0,1 mM EGTA und 5 mM Phosphokreatin (pH 7,3). Das Liquid-Junction-Potential wird nicht korrigiert. Die passiven elektrischen Membraneigenschaften der aufgezeichneten PCs wurden anhand der gemittelten Spuren von 20 Stromreaktionen geschätzt, die durch hyperpolarisierende Spannungsimpulse (von –70 bis –75 mV, 500 ms Dauer) im Spannungsklemmenmodus hervorgerufen wurden. Um durch parallele Fasern (PF) hervorgerufene EPSCs aufzuzeichnen, wurde die extrazelluläre ACSF-Lösung (siehe Abschnitt „Konfokale Live-Bildgebung“ weiter unten) mit Picrotoxin (100 µM) ergänzt, um GABAA-Rezeptor-vermittelte inhibitorische synaptische Ströme zu blockieren, und PFs wurden durch Anwenden von Quadraten stimuliert Impulse (60 µs, 10–60 µA) durch eine Glaspipette, die mit der extrazellulären Lösung gefüllt und in der molekularen Schicht der Kleinhirnscheibe platziert ist. Für die Aufzeichnung extrazellulärer loser Pflaster wurden die Patchpipetten mit extrazellulärer Lösung gefüllt und in der Nähe der Somata der GFP-positiven PCs (lose zellgebunden) platziert. Spontane Aktionsströme (erzeugt durch spontanes neuronales Feuern) wurden mit einem EPC-8-Verstärker (HEKA Elektronik GmbH, Deutschland) mindestens 1 Minute lang bei einem Pipettenpotential von 0 mV aufgezeichnet. Das Auftreten von Spitzen wurde mithilfe der Stromschwellenwertermittlung erkannt. Wenn die Wellenformen der erfassten Aktionsströme nicht einheitlich waren, wurden die Daten verworfen. Die Intervalle zwischen den Spitzen aller erkannten Ereignisse wurden in jedem PC gemessen und ein Durchschnitt der Intervalle wurde als repräsentativer Wert für jeden aufgezeichneten PC herangezogen. Alle elektrophysiologischen Daten wurden mit der pCLAMP10-Software (Molecular Devices) erfasst und mit Igor Pro 8 (Wavemetrics) mit Neuromatic (http://www.neuromatic.thinkrandom.com/)59 und maßgeschneiderten Igor-Verfahren von NH analysiert.

Statistische Analysen wurden mit IBM SPSS Statistics 22 (IBM Corp., Armonk, NY) und GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) durchgeführt. Alle Daten wurden für jeden Test auf Übereinstimmung mit den statistischen Annahmen überprüft, einschließlich Normalverteilung und gleichen Varianzen zwischen den Gruppen. Sofern nicht anders angegeben, werden die Daten als Mittelwert ± SEM dargestellt und zur Beurteilung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige ungepaarte t-Tests oder ANOVA-Mehrfachvergleichstests verwendet. Quantitative Daten der Mikroglia-Spezifität im Kleinhirn eine Woche nach der Virusinjektion wurden mit dem nichtparametrischen Kruskal-Wallis-Test analysiert, da die Datennormalität nicht bestätigt wurde, und ein Post-hoc-Dunn-Test mit Bonferroni-Anpassung für mehrere Vergleiche wurde verwendet, um die statistische Signifikanz zu bestimmen (Tabelle 1). ). Elektrophysiologische Daten der PF-EPSC-Amplitude und des Paarimpulsverhältnisses wurden unter Verwendung mehrerer t-Tests analysiert, die mit der Holm-Sidak-Methode bzw. einer Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen korrigiert wurden (ergänzende Abbildung 10d, e). Die statistische Signifikanz wurde bei P < 0,05 (oder einem für mehrere Vergleiche korrigierten Äquivalent) berücksichtigt. Es wurden keine statistischen Methoden verwendet, um die Stichprobengrößen vorab zu bestimmen, aber unsere Stichprobengrößen ähnelten denen in früheren Studien. In Diagrammen für elektrophysiologische Experimente werden parallel Balkendiagramme dargestellt, die Mittelwerte und die einzelnen Datenpunkte darstellen. In Boxplots stellen Mittellinien, Box-Bonds und Whiskers den Median, das 25./75. Perzentil bzw. die Minimal-/Maximumwerte dar. Weitere Einzelheiten zur statistischen Analyse finden Sie in den Legenden zu den Abbildungen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Das in dieser Studie verwendete Plasmid, das den Iba1-Promotor und zwei Arten von miR.T enthält, ist bei Addgene erhältlich (Addgene-ID: 190163). Mit dieser Studie verbundene mikrogliale morphologische Veränderungen sind in der Arbeit und den ergänzenden Filmen enthalten. Die Quelldaten für alle zugehörigen Diagramme werden in der Datei „Supplementary Data 1“ bereitgestellt. Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor HH erhältlich.

Alle individuell geschriebenen Analysecodes sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Asako Ohnishi, Nobue McCullough und Ayako Sugimoto für die Produktion der AAV-Vektoren, Junko Sugiyama für die Aufzucht der Mäuse und Junko Sugi für einige Mäuseexperimente. Diese Forschung wurde teilweise durch das Programm „Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies“ (Brain/MINDS) der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) unter den Fördernummern JP19dm0207057, JP20dm0207057, JP21dm0207111 und JSPS KAKENHI (Grantnummern 15H04254) unterstützt , 16K15477, 18H02521, 15K18330, 19K06899 und 22K06454).

Abteilung für Neurophysiologie und Neuralreparatur, Gunma University Graduate School of Medicine, Maebashi, Gunma, 371-8511, Japan

Yukihiro Okada, Nobutake Hosoi, Yasunori Matsuzaki, Yuuki Fukai, Akito Hiraga, Keisuke Nitta, Yoichiro Shinohara, Ayumu Konno und Hirokazu Hirai

Abteilung für orale Physiologie, Zahnmedizin für Krankheitsmanagement, Tohoku University Graduate School of Dentistry, Sendai, 980-8575, Japan

Junichi Nakai

Viral Vector Core, Gunma University, Initiative for Advanced Research, Maebashi, Gunma, 371-8511, Japan

Ayumu Konno und Hirokazu Hirai

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YO, AK und HH haben die Experimente entworfen; YO, KN, YS, YM, YF, AH, NH und AK führten die Forschung durch; NH führte die Ca2+-Bildgebungsexperimente durch; JN stellte das experimentelle Material zur Verfügung; YO hat den Entwurf entworfen und HH hat die Studie abgeschlossen.

Korrespondenz mit Hirokazu Hirai.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Guochun Jiang, Negin Martin und Sandra Siegert für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptherausgeber: Eliana Scemes, Veronique van den Berghe und Christina Karlsson Rosenthal. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Okada, Y., Hosoi, N., Matsuzaki, Y. et al. Entwicklung von auf Mikroglia gerichteten adeno-assoziierten viralen Vektoren als Werkzeuge zur Untersuchung des Mikroglia-Verhaltens in vivo. Commun Biol 5, 1224 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04200-3

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Eingegangen: 04. Juli 2022

Angenommen: 31. Oktober 2022

Veröffentlicht: 11. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04200-3

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