Multisensorisches Lernen verbindet Neuronen zu einem Kreuz

Nature Band 617, Seiten 777–784 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Verknüpfung mehrerer Sinnesreize mit Objekten und Erfahrungen ist ein grundlegender Gehirnprozess, der die Objekterkennung und Gedächtnisleistung verbessert. Allerdings sind neuronale Mechanismen, die sensorische Merkmale beim Lernen binden und den Gedächtnisausdruck steigern, unbekannt. Hier demonstrieren wir das multisensorische appetitive und aversive Gedächtnis bei Drosophila. Die Kombination von Farben und Gerüchen verbesserte die Gedächtnisleistung, selbst wenn jede Sinnesmodalität einzeln getestet wurde. Die zeitliche Kontrolle der neuronalen Funktion ergab, dass visuell selektive Pilzkörper-Kenyon-Zellen (KCs) für die Verbesserung sowohl des visuellen als auch des olfaktorischen Gedächtnisses nach multisensorischem Training erforderlich sind. Spannungsbildgebung bei kopffixierten Fliegen zeigte, dass multisensorisches Lernen die Aktivität zwischen Strömen modalitätsspezifischer KCs bindet, sodass ein unimodaler sensorischer Input eine multimodale neuronale Reaktion erzeugt. Die Bindung erfolgt zwischen Regionen der olfaktorischen und visuellen KC-Axone, die eine valenzrelevante dopaminerge Verstärkung erhalten, und wird stromabwärts propagiert. Dopamin löst lokal die GABAerge Hemmung aus, um bestimmten Mikroschaltkreisen in KC-übergreifenden serotonergen Neuronen die Funktion als erregende Brücke zwischen den zuvor „modalitätsselektiven“ KC-Strömen zu ermöglichen. Die modalübergreifende Bindung erweitert dadurch die KCs, die das Gedächtnis-Engramm für jede Modalität repräsentieren, in solche, die die andere repräsentieren. Diese Erweiterung des Engramms verbessert die Gedächtnisleistung nach multisensorischem Lernen und ermöglicht es einem einzelnen sensorischen Merkmal, die Erinnerung an die multimodale Erfahrung abzurufen.

Das Leben ist für die meisten Tiere eine reichhaltige multisensorische Erfahrung. Infolgedessen haben sich Nervensysteme so entwickelt, dass sie multisensorische Darstellungen von Objekten, Szenen und Ereignissen nutzen, um das Verhalten am effektivsten zu steuern1. Es wird allgemein anerkannt, dass multisensorisches Lernen die Gedächtnisleistung verbessert, von Kindern im Klassenzimmer bis hin zu Nagetieren und Insekten in kontrollierten Laborexperimenten2,3,4,5. Darüber hinaus besteht ein scheinbar universelles und ungeklärtes Merkmal des multisensorischen Lernens darin, dass es die spätere Gedächtnisleistung sogar für die einzelnen unsensorischen Komponenten verbessert3,5. Studien an Menschen und anderen Säugetieren haben gezeigt, dass multisensorisches Lernen von Interaktionen zwischen modalitätsspezifischen Kortizes profitiert, die während des Trainings koaktiv waren, und dass einzelne Sinne beide Bereiche beim Testen reaktivieren können3,6,7,8,9. Darüber hinaus reagieren Zellen in verschiedenen Gehirnregionen auf mehrere sensorische Hinweise und die Proportionen oder Zahlen ändern sich nach multisensorischem Lernen1,10,11,12. Allerdings fehlt uns derzeit ein detailliertes mechanistisches Verständnis darüber, wie multisensorisches Lernen Neuronen von modalitätsselektiven zu multimodalen Eigenschaften umwandelt und wie eine verbesserte multisensorische und unsensorische Gedächtnisleistung durch einen solchen Prozess unterstützt werden könnte.

In Drosophila erhalten einzigartige Populationen von Pilzkörper-KCs (MB) überwiegende und anatomisch getrennte dendritische Eingaben von olfaktorischen oder visuellen Projektionsneuronen (sowie lokalen visuellen Interneuronen), und ihre Axone projizieren als parallele Ströme in die MB-Lappen. Dort werden aufeinanderfolgende Kompartimente des Axondorns jedes KC von den Präsynapsen dopaminerger Neuronen (DANs) durchschnitten, die die verstärkende Wirkung appetitanregender oder aversiver Reize übermitteln13,14. Die Verstärkung von Dopamin unterdrückt die Synapsen zwischen aktiven KCs und den kompartimentbeschränkten Dendriten der nachgeschalteten MB-Ausgabeneuronen, um valenzspezifische Erinnerungen zu kodieren15,16,17.

Um das multisensorische Lernen bei Drosophila zu untersuchen, haben wir das olfaktorische T-Labyrinth18 so angepasst, dass Farben und Gerüche gemeinsam präsentiert werden können (Abb. 1a). Fliegen, denen die Nahrung entzogen wurde, wurden trainiert, indem ihnen eine Farbe und/oder ein Geruch präsentiert wurde (konditionierter Reiz minus (CS−)), gefolgt von einer anderen Farbe und/oder einem anderen Geruch (konditionierter Reiz plus (CS+)), gepaart mit einer Zuckerbelohnung (Abb. 1a,b). Beim Training und Test nur mit Farben (visuelles Lernen) zeigten Fliegen keine signifikante erlernte Präferenz für die zuvor gepaarte Farbe (Abb. 1b–d und erweiterte Daten Abb. 1a). Die Kombination von Farben mit Gerüchen (kongruentes Protokoll) führte jedoch zu einem robusten und langlebigen Gedächtnis, das im Vergleich zu dem, das durch Training nur mit Gerüchen (olfaktorisches Lernen) gebildet wurde, deutlich verbessert wurde (Abb. 1b–d und erweiterte Daten Abb. 1a, b). Wenn Farb- und Geruchskombinationen zwischen Training und Test ausgetauscht wurden (inkongruentes Protokoll) (Abb. 1b–d und erweiterte Daten Abb. 1a, b), wurde keine Gedächtnisverbesserung beobachtet. Darüber hinaus war eine Verbesserung des Gedächtnisses nicht erkennbar, wenn während des Trainings und Tests dieselbe Farbe mit CS−- und CS+-Gerüchen präsentiert wurde (Extended Data Abb. 1c). Die gedächtnissteigernde Wirkung des multisensorischen Lernens erfordert daher eine erlernte Beziehung zwischen bestimmten Farb- und Geruchskombinationen. Für das Gedächtnis, das 6 Stunden nach dem Training gemessen wurde, zeigte das inkongruente Protokoll im Vergleich zu dem nach olfaktorischem Lernen eine deutlich verminderte Leistung (Abb. 1d), was darauf hindeutet, dass Fliegen in Konflikt geraten, wenn die Farb-Geruch-Kontingenz zwischen Training und Test gewechselt wird.

a, Gerät für multisensorisches Training und Test (links) und der experimentelle Zeitplan (rechts). b, Protokolle. Die grünen und blauen Quadrate stellen Farben dar, und die hell- und dunkelgrauen Quadrate stehen für Gerüche von 3-Octanol (OCT) und 4-Methylcyclohexanol (MCH). Für das visuelle (V) Lernen wurden Farben als CS+ und CS− verwendet. Für das olfaktorische (O) Lernen wurden Gerüche als CS+ und CS− verwendet. Für das kongruente (C) Protokoll wurden Farben + Gerüche als CS+ und CS− kombiniert und die gleichen Farb- + Geruchskombinationen wurden für Training und Tests verwendet. Für das Inkongruenzprotokoll (I) wurden Farben + Gerüche als CS+ und CS− kombiniert, die Kombinationen wurden jedoch zwischen Training und Test gewechselt. Für das olfaktorische Retrieval (OR) wurden zum Training Farb- und Geruchskombinationen verwendet, zum Testen wurden jedoch nur Gerüche verwendet. Für das visuelle Abrufen (VR) wurden zum Training Farb- und Geruchskombinationen verwendet, zum Testen wurden jedoch nur Farben verwendet. c,d, Trainings- und Testzeitpläne (oben) und sofortiger (c) und 6-stündiger (d) Speicher für V-, O-, C- und I-Protokolle (unten). e,f, Zeitleisten (oben) und multisensorisches Training mit Farben und Gerüchen, die unmittelbar (e) und 6 Stunden (f) nach dem Training für jede einzelne Modalität getestet wurden (unten). Sternchen kennzeichnen einen signifikanten Unterschied (P < 0,05). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Einzelne als Punkte dargestellte Datenpunkte entsprechen unabhängigen Experimenten. Die Gruppen wurden mithilfe einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Tukey-Test (c,d) und dem ungepaarten zweiseitigen t-Test (e,f) verglichen. Genaue P-Werte und Vergleiche finden Sie in den Zusatzinformationen. n = 8 für V und n = 10 für O, C und I (c); n = 10 (d); n = 10 (e); und n = 14 für O und OR und n = 10 für V und VR (f).

Um die multimodale Gedächtnisverbesserung weiter zu untersuchen, beschränkten wir die Präsentation multisensorischer Hinweise entweder auf Training oder Tests. Multisensorisches Training verbesserte den Gedächtnisabruf, selbst wenn jede Modalität während des Tests einzeln präsentiert wurde (olfaktorischer Abruf und visueller Abruf) (Abb. 1e, f). Im Gegensatz dazu hat die Präsentation multisensorischer Reize nur während des Tests die Leistung nicht erleichtert (multisensorischer Abruf) (Extended Data Abb. 1d). Darüber hinaus wurde die größte Leistungsverbesserung beobachtet, wenn multisensorische Reize während des Trainings und Tests verwendet wurden (Extended Data Abb. 1e). Daher verbessert multisensorisches Training die Gedächtnisleistung für die einzelnen Farb- und Geruchsgedächtniskomponenten, und die Kongruenz der Farb- und Geruchsinformationen zwischen Training und Test verbessert die Leistung weiter. Obwohl unsere Experimente und andere Experimente19 darauf hindeuten, dass Fliegen grüne und blaue Farben unterscheiden können, schließen wir einen Beitrag von Farbton und Leuchtdichte nicht aus.

Dendriten der zahlenmäßig größeren Populationen olfaktorischer KCs innerhalb des αβ-Lappens, des α′β′-Lappens und des γ-Lappens (d. h. γ-Haupt(γm-KCs)) besetzen die Hauptkelche des MB, wohingegen die relativ kleinen Populationen von αβ-posterioren (αβp) und γ-dorsalen (γd) KCs erhalten überwiegend visuelle Informationen über Dendriten in den akzessorischen Kelchen14. γd-KCs waren zuvor am Farblernen beteiligt 19,20. Wir haben die Rolle visueller γd- und αβp-KCs beim multisensorischen Lernen und Gedächtnis getestet, indem wir die zellspezifische Expression eines UAS-Shibirets1-Transgens (Shits1) verwendet haben, das ein dominantes temperaturempfindliches Dynamin kodiert21. Bei Temperaturen über 30 °C blockiert Shits1 das Membranrecycling und beeinträchtigt so die synaptische Übertragung, wohingegen die Funktion wiederhergestellt werden kann, indem die Fliegen auf weniger als 29 °C gebracht werden. Durch das Blockieren der Ausgabe von γd- und αβp-KCs während des Tests nach 6 Stunden wurde die visuelle Verbesserung der Leistung im kongruenten Protokoll aufgehoben und die Störung durch Inkongruenz beseitigt. In beiden Fällen war die Gedächtnisleistung ähnlich wie bei Fliegen, die nur mit Gerüchen getestet wurden (Abb. 2a–d und erweiterte Daten Abb. 2a–f). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Aktivität in γd- und αβp-KCs die visuelle Komponente des multisensorischen Gedächtnisses darstellt (siehe auch erweiterte Daten, Abb. 2g, h). Das Blockieren der Ausgabe von γd-KCs (jedoch nicht von αβp-KCs) während des Tests beeinträchtigte auch die Leistung bei der Erinnerungsabfrage nur durch Gerüche bei multisensorisch trainierten Fliegen (Abb. 2e, f), obwohl es keinen Einfluss auf die Gedächtnisabfrage bei Fliegen hatte, die nur mit Gerüchen trainiert wurden22 (Extended Data Abb . 2a,d). Dieses unerwartete Ergebnis veranlasste uns zu der Hypothese, dass multisensorisches Lernen die Darstellung von Gerüchen um „visuelle“ γd-KCs erweitern könnte.

a, Schematische Darstellung von γd-KCs (oben links) und die Zeitleiste mit Temperaturverschiebung (gestrichelte Linie) (unten links). Die blockierende Ausgabe von γd-KCs während des Tests mit MB607B-GAL4;UAS-Shits1 im kongruenten Protokoll ist ebenfalls dargestellt (rechts). b, Blockieren der Ausgabe von γd-KCs während des Tests im inkongruenten Protokoll. c, Schematische Darstellung von αβp-KCs (oben links) und die Zeitleiste mit Temperaturverschiebung (unten links). Die Blockierung der Ausgabe von αβp-KCs während des Tests mit c708a-GAL4;UAS-Shits1 im kongruenten Protokoll ist ebenfalls dargestellt (rechts). d, Blockierung der Ausgabe von αβp-KCs während des inkongruenten Protokolls. e,f, Zeitleiste mit Temperaturverschiebung (oben) und blockierender Ausgabe von γd (e) und αβp (f) KCs während des Tests des olfaktorischen Abrufs des multisensorischen Gedächtnisses (unten). Sternchen kennzeichnen einen signifikanten Unterschied (P < 0,05). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Einzelne als Punkte dargestellte Datenpunkte entsprechen unabhängigen Experimenten. Alle Gruppen wurden unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Tukey-Test verglichen; Genaue P-Werte und Vergleiche finden Sie in den Zusatzinformationen. n = 12 (a,b,d,f) und n = 10 (c,e). Siehe Erweiterte Daten Abb. 2 für Steuerelemente.

Um nach dem multisensorischen Training erlernte, durch Gerüche hervorgerufene Reaktionen in γd-KCs direkt zu testen, haben wir den Spannungssensor UAS-ASAP2f23 in γd-KCs ausgedrückt und eine Zwei-Photonen-Funktionsbildgebung durchgeführt (Abb. 3a – d und erweiterte Daten Abb. 3a, b, f). ,G). Die Fliegen erhielten ein multisensorisches (Farbe + Geruch), unsensorisches (Geruch) oder ungepaartes (Zucker präsentiert 2 Minuten nach Farbe + Geruch) Training. Sechs Stunden nach dem Training wurden Fliegen auf CS+- und CS−-Geruchsreaktionen untersucht. Aufzeichnungen von γd-KC-Axonen wurden im terminalen γ5-Kompartiment des MB-Horizontallappens durchgeführt, da zuckerbelohnende DANs eine lernrelevante präsynaptische Depression der KC-MB-Ausgangsneuronsynapsen in γ4- und γ5-Kompartimenten antreiben24,25. Zum Vergleich haben wir die Reaktionen von γd-KCs im proximalen γ1-Kompartiment abgebildet, in dem sich das präsynaptische Feld von DANs befindet, die aversive Lehrsignale bereitstellen26,27,28. Es wurde zuvor gezeigt, dass die Geruchspräsentation eine langsame Hemmung der γd19- und αβp22-KCs naiver Fliegen hervorruft. Wir fanden heraus, dass die Präsentation des CS−-Geruchs unabhängig vom Trainingsprotokoll eine Hyperpolarisierung von γd-KCs sowohl im γ1- als auch im γ5-Kompartiment hervorrief (Abb. 3a – d und Extended Data Abb. 3a, b, hellviolette Spur). Nach multisensorischem Training führte der CS+-Geruch jedoch zu einer signifikanten Depolarisation der γd-KC-Axone im γ5-Kompartiment (Abb. 3a, dunkelviolette Spur). CS+-Reaktionen im γ1-Kompartiment schienen weniger hemmend zu sein als die auf CS− (Abb. 3b; obwohl die Reaktionen statistisch nicht unterscheidbar waren), möglicherweise aufgrund der Modulation der PPL1-γ1pedc-DANs durch den Hungerzustand der Fliege29,30. Die durch multisensorisches Training bedingte Vorzeichenumkehr der γd-KC-Geruchsreaktion in γ5 trat nicht nach unsensorischem Nur-Geruch-Training (Abb. 3c, dunkelviolette Spur) oder ungepaartem Training (Extended Data Abb. 3a, dunkelviolette Spur) auf. In diesen Fällen riefen sowohl CS+- als auch CS−-Gerüche eine Hyperpolarisation in den Kompartimenten γ1 und γ5 hervor (Abb. 3c, d und erweiterte Daten Abb. 3a, b). Die Bildgebung farbbedingter Signale zeigte starke Reaktionen auf beide Farben in γd-KCs naiver Fliegen (Extended Data Abb. 3c). Die Aufzeichnung von γm-KCs zeigte nach dem multisensorischen Training einen ausgeprägten, auf das γ5-Kompartiment beschränkten Erregungsgewinn durch die CS+-Farbe, ohne dass sich die Reaktionen im γ1-Kompartiment veränderten (Abb. 3e, f; beachten Sie, dass die Bilderkennung durch Laserscanning währenddessen durch einen Verschluss blockiert wird). Farbdarstellung). Pulsierendes farbiges Licht, das für diese Bildgebungsexperimente erforderlich ist, beeinträchtigte weder das multisensorische Lernen und das visuelle Abrufen (Extended Data Abb. 3d, e) noch die γm-KC-Reaktionen auf Gerüche (Extended Data Abb. 3h, i). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dopaminerge Belohnungslehrsignale die durch CS+-Geruch und CS+-Farbe hervorgerufene Erregung innerhalb des γ-KC-Ensembles erweitern, indem sie die γ5-Segmente der γd-KC-Axone rekrutieren, um geruchsaktiviert und γm-farbaktiviert zu werden (Abb. 3g). Diese größeren Farb- und Geruchsgedächtnis-Engramme stellen einen Mechanismus dafür dar, wie die Leistung des Geruchs- und Farbgedächtnisses nach einem multisensorischen Training verbessert wird (Abb. 1e, f) und erklären, warum das Abrufen des Geruchsgedächtnisses in diesem Zusammenhang eine Anforderung für die γd-KC-Ausgabe stellt (Abb. 2e). ).

In den Feldern a–f Zeitpläne für appetitives multisensorisches (Farbe + Geruch) oder appetitives unisensorisches (Geruch) Training, gefolgt von der Geruchs- oder Farbreaktionsbildgebung (oben links); Bildebene entweder im γ5- oder γ1-Bereich von γd- oder γm-KC-Axonen (unten links); Spuren von CS+- und CS−-geruchsbedingter Aktivität (Mitte); und Quantifizierung der Antworten (rechts) werden angezeigt. a, γ5-Region von γd-KC-Axonen zeigte nach multisensorischem Training eine erregende Reaktion auf den CS+-Geruch (eine Abnahme der Fluoreszenz erhöht das –ΔF/F0 des ASAP2f-Spannungssensors). γ5-Axone wurden durch den CS−-Geruch gehemmt (Abnahme von −ΔF/F0). b: Erregende Reaktionen auf den CS+-Geruch wurden bei γ1 nicht beobachtet und der CS−-Geruch löste eine Hemmung aus. c,d, Sowohl die γ5- (c) als auch die γ1-Region (d) zeigten nach appetitivem unisensorischem (Geruchs-)Training eine Hemmung der Gerüche CS+ und CS−. e, die γ5-Region der γm-KC-Axone zeigte nach multisensorischem Training eine erregende Reaktion nur auf die CS+-Farbe. f: Eine Anregung der CS+-Farbe wurde in γ1 nicht beobachtet. Für alle Spuren und Quantifizierungen in dieser Studie entsprechen die CS+-Daten durchschnittlichen Antworten, bei denen die Hälfte der Versuche Blau oder MCH als CS+ und die andere Hälfte Grün oder OCT als CS+ verwendete. Gleiches gilt für CS−Daten. Durch Geruch oder Farbe hervorgerufene Aktivitätsspuren zeigen den Mittelwert (durchgezogene Linie) mit dem Halbwert (Schatten). Horizontale gestrichelte Linien zeigen die Grundaktivität an. In a–d markiert die durchgezogene schwarze Linie unter den Spuren die 5-sekündige Geruchsexposition. In e und f entspricht der vertikale graue Balken der 0,75-s-Farbdarstellung bei geschlossener Bildaufnahme und das gepunktete Kästchen entspricht der 1,75-s-Quantifizierungsperiode. Sternchen kennzeichnen einen signifikanten Unterschied zwischen den durchschnittlichen CS+- und CS−-Antworten (P < 0,05). CS+- und CS–-Antworten für jede Fliege sind durch eine gestrichelte Linie verbunden. Alle Gruppen wurden mithilfe eines gepaarten zweiseitigen T-Tests verglichen. Genaue P-Werte und Vergleiche finden Sie in den Zusatzinformationen. n = 26 Fliegen (a,b); n = 24 Fliegen (c); n = 22 Fliegen (d); und n = 16 Fliegen (e,f). g, MB-Modell für appetitliches multisensorisches Farb- und Geruchstraining, gefolgt von unsensorischen Geruchs- oder Farbtests. γm-KCs erhalten dendritische olfaktorische Eingaben und γd-visuelle Eingaben. Beide γ-KC-Typen projizieren Axone durch die γ1–γ5-Kompartimente des MB-γ-Lappens. Appetitives Training (links) aktiviert Belohnungs-DANs (grün), die γ4 und γ5 innervieren, deren freigesetztes Dopamin das Lernen kodiert, indem es Synapsen49 zwischen geruchsaktivierten KCs und vermeidungssteuernden MB-Ausgangsneuronen unterdrückt (nicht dargestellt)14. Die Dopaminsignalisierung beim multisensorischen Lernen bindet auch die γm- und γd-KC-Aktivität in den γ4–γ5-Kompartimenten. Bei zukünftigen unsensorischen Geruchstests (Mitte) erregt der CS+-Geruch spezifische γm-KCs (dicker grauer Pfeil), die wiederum γd-Axone in γ4–γ5-Kompartimenten aktivieren (graue gestrichelte Linien nach gelb). Die umgekehrte γd-vermittelte Aktivierung von γm-KCs erfolgt bei unsensorischen Farbtests (rechts).

Die Spannungsbildgebung der γd-KC-Somata zeigte nach multisensorischem Belohnungstraining keine Geruchsaktivierung (Extended Data Abb. 3f, g), was darauf hindeutet, dass die lerngesteuerte Rekrutierung dieser Neuronen, die auf Gerüche reagieren, nicht durch die Verstärkung des dendritischen Inputs erfolgt. Wir haben daher ein Modell der axonalen Rekrutierung weiter getestet. Wir kamen zu dem Schluss, dass, wenn DANs die Rekrutierung von γd-Axonen steuern, damit sie geruchsaktiviert werden (und γm-Axone, damit sie farbaktiviert werden), ein aversives Lernereignis, das die Freisetzung von Dopamin aus den PPL1-γ1pedc-DANs erfordert, die das proximalste γ1-Lappenkompartiment innervieren, Geruch verleihen sollte Reaktionsfähigkeit auf alle stromabwärts gelegenen γd-Axonsegmente von γ1 bis γ5. Wir haben bestätigt, dass multisensorisches Farb- und Geruchsaversivtraining (Elektroschock) zu einer Gedächtnisverbesserung sowohl für kombinierte als auch für einzelne Hinweise führt, ähnlich wie nach dem Appetittraining (Extended Data Abb. 4a – f), und dass auch γd-KCs für das Geruchsgedächtnis erforderlich sind Verbesserung nach aversivem multisensorischem Training (Extended Data Abb. 4g – l). Als nächstes verwendeten wir die Zwei-Photonen-Spannungsbildgebung, um zu testen, ob γd-Axone ab γ1 nach multisensorischem aversivem Lernen eine CS+-Geruchsaktivierung erlangten. Die Präsentation des CS−-Geruchs rief unabhängig vom Trainingsprotokoll eine Hyperpolarisierung von γd-KCs sowohl im γ1- als auch im γ5-Kompartiment hervor (Abb. 4a, b und Extended Data Abb. 4m – p, hellviolette Spur). Im Gegensatz dazu erzeugte CS+-Geruch nach multisensorischem aversivem Training eine kurze Anregung von γd-KCs in γ1 und γ5 (Abb. 4a, b, dunkelviolette Spur). Aufzeichnungen von Geruchsreaktionen in γd-KCs nach appetitivem und aversivem multisensorischem Lernen sowie von durch Farbe hervorgerufenen γm-KCs nach appetitivem multisensorischem Lernen stimmen daher mit der Position von DAN-Lehrsignalen überein, die den Teil eines γ-KC-Axons bestimmen, der durch aktiviert wird andere CS+-Modalität. Während aversives Lernen alle Axonsegmente stromabwärts von γ1 durch die reziproke Modalität erregbar macht (Abb. 4c), verändert Belohnungslernen hauptsächlich die CS+-Erregung innerhalb der Segmente γ4 und γ5 (Abb. 3g).

a,b, Zeitpläne für aversives multisensorisches (Farbe + Geruch) Training und Geruchsbildgebung (oben links). Die Bildebene entweder im γ1-Bereich (a) oder im γ5-Bereich (b) der γd-KC-Axone (unten links). Spuren von CS+- und CS−-geruchsbedingter Aktivität (Mitte). Quantifizierung der durch Gerüche hervorgerufenen Reaktionen (rechts). Die γ1-Region zeigte nach aversivem multisensorischem Training eine Anregung des CS+-Geruchs und eine Hemmung des CS−-Geruchs (a). Der CS+-Geruch rief bei γ1 eine geringere Hemmung hervor als CS− (b). Geruchsbedingte Aktivitätsspuren zeigen den Mittelwert (durchgezogene Linie) mit dem Halbwert (Schatten). Horizontale gestrichelte Linien zeigen die Grundaktivität an. Die durchgezogene schwarze Linie unter den Spuren markiert die 5-sekündige Geruchsexposition. Sternchen kennzeichnen einen signifikanten Unterschied zwischen den durchschnittlichen CS+- und CS−-Antworten (P < 0,05). CS+- und CS–-Antworten für jede Fliege sind durch eine gestrichelte Linie verbunden. c, MB-Modell für aversives multisensorisches Training, gefolgt von Geruchstests. Aversives multisensorisches Training (links) greift Bestrafungs-DANs (rot) an, die Synapsen16,17 zwischen γm- und γd-KCs unterdrücken und die Annäherungssteuerung der γ1- und γ2-MB-Ausgangsneuronen16,17 (nicht dargestellt) ermöglichen, während sie gleichzeitig die γd- und γm-KC-Aktivität in diesen Kompartimenten binden. Unisensorische Geruchstests (rechts) regen spezifische γm-KCs an, die γd-Axone ab γ1 aktivieren. d,e, Früheres aversives multisensorisches Lernen verbessert zukünftiges appetitliches, aber nicht aversives Geruchslernen. Protokolle werden angezeigt (links). Ausgehungerte Fliegen wurden in aversives multisensorisches Training (Gruppe I) und aversives unsensorisches Geruchstraining (Gruppe II) unterteilt. Drei Stunden später wurden beide Gruppen mit Gerüchen und Zuckerbelohnung trainiert (unter Verwendung der gleichen CS+- oder CS–-Gerüche wie beim ersten Training) und unmittelbar danach getestet. Auch die Speicherleistung wird angezeigt (rechts). Gruppe I, die zunächst mit dem multisensorischen aversiven Protokoll trainierte, schnitt besser ab als Gruppe II, die zunächst nur mit Gerüchen trainierte (d). Gruppe I, die ursprünglich mit dem multisensorischen Appetitprotokoll trainiert wurde, übertraf die Gruppe II, die ursprünglich nur mit Gerüchen trainiert hatte, nicht (e). Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede (P < 0,05). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Einzelne als Punkte dargestellte Datenpunkte entsprechen unabhängigen Experimenten. Die Gruppen wurden mithilfe des gepaarten zweiseitigen T-Tests (a,b) und des ungepaarten zweiseitigen T-Tests (d,e) verglichen. Genaue P-Werte und Vergleiche finden Sie in den Zusatzinformationen. n = 24 Fliegen (a,b), n = 12 (d) und n = 8 (e).

Es ist zu erwarten, dass eine Erweiterung der CS+-Geruchsdarstellung in ein bestimmtes Segment der γd-Axone nach dem multisensorischen Training das nachfolgende Lernen mit demselben Geruch erleichtert, wenn das nächste DAN-Lehrsignal die erweiterte KC-Darstellung schneidet. Wir haben diese Vorstellung getestet, indem wir Fliegen nacheinander entweder mit einem aversiven (Dopamin in γ1) oder appetitiven (Dopamin in γ4 und γ5) multisensorischen Protokoll trainiert haben, gefolgt von unsensorischem Geruchsbelohnungs- oder Geruchsbestrafungslernen (Abb. 4f, g). Vorheriges multisensorisches aversives Training verbesserte das nachfolgende Geruchs-Belohnungs-Lernen erheblich (Abb. 4d). Es war jedoch keine Verbesserung erkennbar, wenn aversives Geruchslernen auf multisensorisches appetitives Lernen folgte (Abb. 4e). Daher kann die vom multisensorischen Training abhängige Erweiterung der CS+-Geruchsdarstellung in das nächste CS+-Geruchsgedächtnis-Engramm einbezogen werden, wenn entsprechende γd-Axonsegmente durch CS+-Geruch aktiviert wurden.

Die Anatomie des MB-Netzwerks legt zwei Möglichkeiten nahe, γd-KC-Axonen Geruchsempfindlichkeit zu verleihen: über KC-KC-Synapsen oder Neuronen, die so positioniert sind, dass sie die verschiedenen KC-Ströme überbrücken. Wir haben die anatomische Machbarkeit dieser Routen anhand des vollständigen MB-Konnektoms eines einzelnen erwachsenen weiblichen Fliegen-„Halbhirn“-Elektronenmikroskopvolumens abgefragt32,33. Obwohl die meisten (562 von 590) γm-KCs Synapsen mit γd-KCs bilden, unterstützen die Anzahl und Platzierung dieser Verbindungen nicht, dass jeder γd-KC γm-Eingaben in jedem γ-Lappen-Kompartiment empfängt. Darüber hinaus wurde berichtet, dass KC-KC-Verbindungen die Aktivität benachbarter KCs unterdrücken34. Als nächstes untersuchten wir die feine Anatomie der γ-Lappen-Innervation des potenziell erregenden serotonergen dorsal gepaarten medialen (DPM) Neurons im elektronenmikroskopischen Volumen des Hemihirns. DPM-Neuronen senden separate Zweige aus, die die vertikalen und horizontalen Lappen und den distalen Stiel des MB dicht innervieren, wo sie sowohl präsynaptisch als auch postsynaptisch für KCs sind35,36,37. Die Ultrastruktur der DPM-Neuronenprojektionen im γ-Lappen zeigte zwei Äste innerhalb von γ1 und andere ventrale und dorsale Äste, die durch die γ2–γ5-Kompartimente verlaufen (Abb. 5a). Die Positionen der neuronalen DPM-Synapsen auf γd-KCs folgen dem γd-KC-Axonbündel, während es sich von ventral im γ1-Kompartiment nach dorsal im γ5-Kompartiment um den γ-Lappen windet (Abb. 5a).

a, 3D-Darstellung von MB (hellgrau) mit DPM-Neuron-γ-Lappen-Neuriten (blaugrün) (links). DPM verzweigt sich (Sternchen) in dorsale (dunkelblaugrün), ventrale (hellblaugrün) und γ1-Kompartimentzweige (blaugrün). Neuriten werden durch die Strahler-Ordnung schattiert und Zweige mit einer Strahler-Ordnung von weniger als 1 wurden beschnitten. Details des γ-Lappens mit γ1–γ5-Kompartimentgrenzen (gestrichelte Linien) werden angezeigt (rechts). DPM-Präsynapsen zu γd-KCs (gelbe Kugeln) kolokalisieren auf dem dorsalen DPM-Zweig in γ5. Eingangssynapsen von γm-KCs (graue Kugeln) zu DPM befinden sich in den ventralen und dorsalen Zweigen. In γ5 bildeten 450 von 585 γm-KCs Synapsen mit dem DPM-Rückenzweig, wobei 89 von 98 γd-KCs auch DPM-Eingabe erhielten. APL-Neuroneneingänge (magentafarbene Kugeln) lokalisieren entlang beider DPM-Zweige. b, 2D-Dendrogrammprojektion von DPM-Neuriten (Blaugrüntöne; Einzelheiten siehe Erweiterte Daten in Abb. 5a). Das γ1-Kompartiment ist markiert und die γ2–γ5-Kompartimente sind zwischen dorsalen und ventralen DPM-Neuronenästen aufgeteilt. Eingaben von γm-KCs (graue Kugeln) und Ausgaben von γd-KCs (gelbe Kugeln) kolokalisieren auf kompartimentspezifischen Zweigen. Hemmende Eingaben vom APL-Neuron (magentafarbene Kugeln) werden über die DPM-Neuriten verteilt. Die APL-Konnektivität wird in Extended Data Abb. 5b detailliert beschrieben. c,d, DPM-Neuronenschema (c; oben). Die Zeitleiste mit Temperaturverschiebung (gestrichelte Linie) wird ebenfalls angezeigt. Die blockierende Ausgabe von DPM-Neuronen mit VT64246-GAL4;UAS-Shits1 während des Trainings (c) oder Testens (d) der 6-Stunden-Abrufleistung wird angezeigt (unten). e,f, Appetitives multisensorisches Training (Farbe + Geruch) und Geruchsbildgebungszeitpläne für DPM-Neuronen (links). Dargestellt sind die Bildebenen in den Regionen γ5 (e) und γ1 (f) von DPM-Neuronen sowie Spuren der durch CS+ und CS− hervorgerufenen Aktivität (Mitte). Die Quantifizierung der Antworten wird angezeigt (rechts). Die γ5- und γ1-Regionen von DPM zeigten erregende Reaktionen auf CS+- und CS−-Gerüche, CS+-Reaktionen waren jedoch nur in γ5 spezifisch verstärkt. g, Zeitleiste (links). Der RNAi-Knockdown von 5-HT2A-, aber nicht von 5-HT2B- oder 5-HT7-Rezeptoren in γd-KCs mit MB607B-GAL4 beeinträchtigte die Geruchserkennungsleistung nach multisensorischem Training. In c,d,g werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, einzelne Datenpunkte werden als Punkte angezeigt und die Sternchen kennzeichnen einen signifikanten Unterschied (P < 0,05). Bkg, RNAi-Hintergrund. h, Zeitleiste für appetitives multisensorisches Training und Geruchsbildgebung (oben links). Die Bildebene in γ5 von γd-KC-Axonen (unten links). Spuren von CS+- und CS−-geruchsbedingter Aktivität (Mitte). 5HT2AR-RNAi eliminierte die durch Geruchsverstärkung hervorgerufene Erregung in γ5 von γd-KCs nach multisensorischem Training (siehe auch Abb. 3a); CS+- und CS−-Gerüche hemmten in ähnlicher Weise γd-KC-Axone. Die Quantifizierung wird ebenfalls angezeigt (rechts). Geruchsbedingte Aktivitätsspuren zeigen den Mittelwert (durchgezogene Linie) mit dem Halbwert (Schatten). Horizontale gestrichelte Linien zeigen die Grundaktivität an.Die durchgezogene schwarze Linie unter den Spuren markiert die 5-sekündige Geruchsexposition. Das Sternchen in e bezeichnet einen signifikanten Unterschied zwischen den durchschnittlichen CS+- und CS−-Antworten (P < 0,05). CS+- und CS–-Antworten für jede Fliege sind durch gestrichelte Linien verbunden. Die Gruppen wurden unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Tukey-Test (c,d), eines gepaarten zweiseitigen t-Tests (e,f,h) und einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Dunnett-Test (g) verglichen. Genaue P-Werte und Vergleiche finden Sie in den Zusatzinformationen. n = 8 für Shi und n = 9 für andere Gruppen (c); n = 10 (d,g); n = 26 Fliegen (e,f); und n = 24 Fliegen (h). Siehe Erweiterte Daten Abb. 7 für Steuerelemente. i, Modell der DPM-Mikroschaltung, die geruchsspezifische und farbspezifische KCs nach multisensorischem Lernen überbrückt.

Die Kommentierung eines Dendrogramms von DPM-Neuriten (Abb. 5b) mit γ-Lappen-Kompartimentgrenzen (basierend auf DAN-Konnektivität), Synapsen von γm-KCs und solchen zu γd-KCs zeigte, dass einzigartige Zweige des DPM-Neurons kompartimentspezifische Mikroschaltkreisbrücken dazwischen bereitstellen können γm- und γd-KCs. DPM-Neuronen können auch γd- zu γm-KCs überbrücken (Extended Data Abb. 5a). Es wurde festgestellt, dass das große GABAerge anterior gepaarte laterale (APL)38-Neuron Synapsen entlang der DPM-Zweige im γ-Lappen bildet (Abb. 5b und erweiterte Daten Abb. 5a), was darauf hindeutet, dass die DPM-Überbrückung durch lokale Hemmung reguliert werden kann. Das APL-Neuron empfängt viele DAN-Eingänge in jedem Kompartiment und kann daher auch mit Regionsspezifität39 reguliert werden (Extended Data Abb. 5b), um möglicherweise bestimmte DPM-Zweige aus der APL-Hemmung freizugeben.

Wir stellten dieses mutmaßliche Mikroschaltkreis-Brückenmodell in Frage, indem wir APL- und DPM-Neuronen unabhängig manipulierten. Die Expression des DopR2-Dopaminrezeptors in APL-Neuronen wurde mit aversivem Lernen in Verbindung gebracht40, und Transkriptionsprofile legen nahe, dass APL-Neuronen auch den DopEcR-Rezeptor exprimieren41. Es ist bekannt, dass beide Dopaminrezeptoren eine hemmende Wirkung haben42,43. Wir haben daher tubP-GAL80ts (Lit. 44) verwendet, um transgene RNAi in APL-Neuronen zeitlich zu beschränken und die Rolle dieser Rezeptoren beim multisensorischen Lernen zu testen. Durch das Ausschalten von Dop2R in erwachsenen APL-Neuronen wurde die multisensorische Verbesserung der olfaktorischen Abrufleistung aufgehoben (Erweiterte Daten, Abb. 6a, c). Ein leichter Defekt des Geruchsgedächtnisses wurde auch nach der Konditionierung des olfaktorischen Appetits beobachtet; Der Unterschied war jedoch nur für eine Kontrolle signifikant (Extended Data Abb. 6b, d). Im Gegensatz dazu hatte DopEcR-RNAi in keinem der Experimente eine Wirkung (Extended Data Abb. 6e, f). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Verstärkung dopaminhemmender APL-Neuronen, um die Rekrutierung von γd-KCs in das olfaktorische Gedächtnis-Engramm während des multisensorischen Lernens zu ermöglichen.

Wir haben die Rolle der serotonergen DPM-Neuronen anhand der Expression von UAS-Shits1 getestet. Die zeitliche Einschränkung der Übertragung von DPM-Neuronen entweder während der Erfassung (Abb. 5c und Extended Data Abb. 7a) oder beim Abrufen (Abb. 5d und Extended Data Abb. 7a) beeinträchtigte die multisensorische Trainingsverbesserung des Geruchsabrufgedächtnisses erheblich. Die Blockierung der neuronalen DPM-Ausgabe beeinträchtigte auch den Abruf des visuellen Gedächtnisses nach multisensorischem Lernen (Extended Data, Abb. 7b). Dieselben Manipulationen hatten keinen Einfluss auf das Geruchsgedächtnis nach unsensorischem olfaktorischem Lernen (Extended Data Abb. 7c), wie in einer früheren Studie45. Diese Daten stimmen damit überein, dass die neuronale DPM-Ausgabe während des Lernens erforderlich ist, um gleichzeitig aktive KC-Ströme zusammenzubinden, wohingegen die neuronale DPM-Ausgabe während des Gedächtnisabrufs die Verbindung für geruchsgesteuerte γm-KCs zur Aktivierung der relevanten γd-KCs bereitstellt.

Als nächstes führten wir Verhaltensexperimente und physiologische Experimente durch, um ein Modell direkt zu testen, bei dem multisensorisches Lernen eine erregende DPM-Neuronen-Mikroschaltungsbrücke zwischen olfaktorischen γm- und visuellen γd-KCs herstellt. Wir haben UAS-Shits1 zunächst verwendet, um zu bestimmen, ob während des Trainings eine γ-KC-Ausgabe (γm und γd) erforderlich war, um den olfaktorischen und visuellen Gedächtnisabruf nach multisensorischem Training zu verbessern. Während die Blockierung von γ-KCs während des multisensorischen Lernens sowohl das olfaktorische als auch das visuelle Abrufen erheblich beeinträchtigte (Extended Data Abb. 7e–h), veränderte es das olfaktorische Lernen nicht (Extended Data Abb. 7d), wie in früheren Studien 46, 47, 48. Die Feststellung, dass die Netzwerkplastizität des multisensorischen Gedächtnisses eine KC-Ausgabe erfordert, lässt darauf schließen, dass es sich hierbei um andere Lernregeln als beim unsensorischen Geruchsgedächtnis handelt16,49.

Wir haben UAS-ASAP2f verwendet, um nach der kompartimentspezifischen Plastizität der funktionellen Konnektivität von DPM-Neuronen nach multisensorischem Belohnungslernen zu suchen. Es wurde gezeigt, dass olfaktorisches Belohnungslernen die Kalziumreaktionen in DPM-Neuronen auf den CS+-Geruch bis zu 2,5 Stunden lang spezifisch steigert (Ref. 36,50) (siehe 1-stündige Spannungsaufzeichnungen; erweiterte Daten, Abb. 7k–l). Die Aufzeichnung 6 Stunden nach dem multisensorischen Training ergab einen deutlichen und spezifischen Anstieg der CS+-Geruchsspannungsreaktionen in DPM-Projektionen im γ5-, nicht jedoch im γ1-Kompartiment (Abb. 5e, f), der zu diesem Zeitpunkt nach dem olfaktorischen Lernen fehlte (Erweiterte Daten). Abb. 7i,j). Dies legt nahe, dass multisensorisches Belohnungslernen Synapsen von CS+-geruchsspezifischen γm-KCs zu DPM-Neuronen innerhalb der Mikroschaltung des γ5-Kompartiments des MB verstärkt. Da unsere vorherige Bildgebung von γd-KCs gezeigt hat, dass auch sie nach multisensorischem Belohnungslernen CS+-Geruch in ihren γ5-Segmenten aktivieren (Abb. 3a), haben wir getestet, ob die Geruchsreaktivität der Verstärkung von γd durch durch DPM-Neuronen freigesetztes Serotonin vermittelt werden kann (5). -Hydroxytryptamin (5-HT)). Wir stellten zunächst fest, dass die Badanwendung von 5-HT (in Gegenwart von Tetrodoxin zur Blockierung der indirekten Aktivierung über andere Neuronen) direkt eine Depolarisation von γd-KCs hervorrief, die UAS-ASAP2f in naiven Fliegen exprimierten (Extended Data Abb. 7o, p). 5-HT kann über Rezeptoren vom Typ 5-HT2A und 5-HT7 erregende Wirkungen ausüben51. Wir verwendeten daher RNAi, um diese Rezeptoren in γd-KCs auszuschalten. Die Reduzierung der 5-HT2A-, aber nicht der 5-HT7- oder 5-HT2B-Rezeptorexpression beeinträchtigte die Leistung des olfaktorischen Gedächtnisses nach multisensorischem Training (Abb. 5g), nicht jedoch nach olfaktorischem Training (Extended Data, Abb. 7q). Darüber hinaus hob die gemeinsame Expression von 5-HT2A-RNAi mit UAS-ASAP2f in γd-KCs die durch multisensorisches Lernen induzierte Verstärkung der CS+-Geruchsaktivierung in der γ5-Region von γd-KCs auf (Abb. 5h), hatte jedoch keinen Einfluss auf die hervorgerufene Farbe Antworten (Extended Data Abb. 7r). Zusammengenommen führen diese anatomischen, genetischen und physiologischen Daten zu dem Schluss, dass durch Verstärker hervorgerufenes kompartimentspezifisches Dopamin eine APL-vermittelte Hemmung auslöst, die es demselben verstärkenden Dopamin erleichtert, KC-DPM- und DPM-KC-Plastizität zu induzieren, die eine erregende serotonerge Geruchsfarbe bildet -spezifische DPM-Mikroschaltungsbrücken zwischen den relevanten γm- und γd-KCs (Abb. 5i) und wahrscheinlich umgekehrt.

Unsere Studie beschreibt einen präzisen neuronalen Mechanismus in Drosophila, durch den multisensorisches Lernen die spätere Gedächtnisleistung verbessert, selbst für einzelne sensorische Hinweise. Ein einzelner Trainingsversuch mit visuellen Hinweisen konnte nur dann eine robuste Gedächtnisleistung erzeugen, wenn diese während des Trainings mit Gerüchen kombiniert wurden, ähnlich wie beim Erlernen der visuellen Rhythmuswahrnehmung beim Menschen, das begleitende auditive Informationen erfordert52. Wir haben gezeigt, dass multisensorisches Lernen Informationen aus zeitlich kontingenten Gerüchen und Farben innerhalb der Axone von MB γ-KCs über serotonerge DPM-Neuronen zusammenbindet, deren Aktivität auch das Zeitfenster der Koinzidenz definiert53. Diese lerngesteuerte Bindung wandelt Axone visuell (vermutlich farblich) selektiver KCs um, sodass sie auch auf den zeitlich bedingten trainierten Geruch reagieren. Wir haben auch gezeigt, dass Axone olfaktorisch selektiver KCs durch die zeitlich bedingte trainierte Farbe aktiviert werden. Obwohl der vorherrschende dendritische Input γm-KCs als olfaktorisch und γd als visuell definiert, zeigten unsere Aufzeichnungen, dass Segmente ihrer Axone nach multisensorischem Lernen multimodal werden. Dieses Ergebnis legt nahe, dass γ-KCs ein wahrscheinliches Substrat sind, auf dem andere zeitlich bedingte sensorische Informationen mit expliziten sensorischen Hinweisen integriert werden können 54, 55.

Obwohl sich unsere Experimente hauptsächlich auf geruchsaktivierte γm-KCs konzentrierten, die Farb-γd-KCs über DPM-Mikroschaltkreise rekrutierten, deuten die beobachtete Verhaltensverbesserung des visuellen Gedächtnisses nach multisensorischem Lernen, der Nachweis, dass γm-KCs auf die trainierte Farbe reagieren, und die wechselseitige Konnektivität von DPM-Neuronen darauf hin dass DPM-Neuronen wahrscheinlich auch eine Brücke mit umgekehrter Polarität vermitteln. Dabei nutzt multisensorisches Lernen DPM-Neuronen, um KCs zu verknüpfen, die auf jeden zeitlich kontingenten sensorischen Hinweis reagieren, und erweitert die Darstellungen jedes Hinweises mit denen des anderen. Diese modalübergreifende Erweiterung ermöglicht es, multisensorische Erfahrungen effizient durch kombinierte Hinweise und durch jeden einzeln abzurufen. Dadurch können trainierte Fliegen mit dem erlernten Geruch eine Erinnerung an ein visuelles Erlebnis und mit der erlernten Farbe eine Erinnerung an einen Geruch hervorrufen. Diese Ergebnisse liefern einen neuronalen Mechanismus, durch den die Fliege ein konzeptionelles Äquivalent zur Hippocampus-abhängigen Mustervervollständigung bei Säugetieren erreicht, bei dem Teilszenen eine vollständigere Gedächtnisdarstellung abrufen können56. Menschliche Patienten mit Schizophrenie und Autismus weisen Defizite in der multisensorischen Integration57 auf, und diese Erkrankungen wurden mit einer serotonergen Dysfunktion und 5-HT2A-Rezeptoren in Verbindung gebracht58. Unsere Arbeit hier legt nahe, dass eine unangemessene Weiterleitung multisensorischer Wahrnehmungen zu diesen Bedingungen beitragen kann. Darüber hinaus sind die erregenden 5-HT2A-Rezeptoren, die die multisensorische Bindung vermitteln, die Hauptziele halluzinogener Drogen59.

Alle Drosophila melanogaster-Stämme wurden, sofern nicht anders angegeben, bei 25 °C und 40–50 % Luftfeuchtigkeit auf Standard-Maismehl-Agar-Nahrung (100 g l-1 wasserfreie D-Glucose, 47,27 g l-1 Bio-Maismehl, 25 g l-1 autolysiert) aufgezogen Hefe, 7,18 g l−1 Agar und 12,18 g Tegosept, gelöst in 8,36 ml absolutem Ethanol, pro Liter Fliegenfutter) im 12:12-h-Licht:Dunkel-Zyklus. Canton-S-Fliegen wurden als Wildtyp (WT) verwendet und stammten aus dem Labor von William Quinn (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA). Die folgenden GAL4-Linien wurden in den Verhaltensexperimenten verwendet: MB607B-GAL4 (Ref. 13,60), MB009B-GAL4 (Ref. 13,60), c708a-GAL4 (Ref. 61), VT43924-GAL4.2 (Ref. 13,60). 39) und VT64246-GAL4 (Ref. 62). Die temperaturgesteuerte Blockierung des neuronalen Outputs wurde durch die Expression des UAS-Shits1-Transgens (Ref. 21) unter der Kontrolle von MB607B-GAL4 (Ref. 13,60), MB009B-GAL4 (Ref. 13,60), c708a- erreicht. GAL4- (Ref. 61) und VT64246-GAL4- (Ref. 62) Treiber. Für RNAi-Knockdown-Experimente mit APL wurden die Fliegen tubP-GAL80ts (Ref. 44), VT43924-GAL4.2 (Ref. 39) mit UAS-Dop2R-RNAi63- und UAS-DopEcR-RNAi-Fliegen (VDRC-ID: 103494) gekreuzt. Die gleiche Treiberlinie wurde mit WT-Fliegen und dem RNAi-Hintergrundstamm (VDRC-ID: 60100) als Kontrolle gekreuzt. Für RNAi-Knockdown-Experimente mit γd-KCs wurden MB607B-GAL4-Fliegen (Ref. 13,60) mit UAS-5-HT2A-RNAi (31882, BDSC), UAS-5-HT2B-RNAi (60488, BDSC) und UAS-5-HT2B-RNAi (60488, BDSC) gekreuzt. HT7 RNAi (27273, BDSC) fliegt. Die gleiche Treiberlinie wurde als Kontrolle mit dem RNAi-Hintergrundstamm (36304, BDSC) gekreuzt. Für Live-Bildgebungsexperimente wurde UAS-ASAP2f64 mit MB607B-GAL4 (Ref. 13, 60) und VT64246-GAL4 (Ref. 62) und UAS-ASAP2s65 mit der Treiberleitung 1471-GAL4 (Ref. 66) ausgedrückt. Für die Verhaltens- und Bildgebungsexperimente verwendeten wir sowohl männliche als auch weibliche Fliegen.

Männliche Fliegen aus den GAL4-Linien wurden mit jungfräulichen UAS-Shits1-Weibchen gekreuzt, mit Ausnahme von Experimenten mit c708a-GAL4, bei denen UAS-Shits1-Männchen mit jungfräulichen c708a-GAL4-Weibchen gekreuzt wurden. Für heterozygote Kontrollen wurden GAL4- oder UAS-Shits1-Fliegen mit WT-Fliegen gekreuzt. In RNAi-Experimenten wurden GAL4- oder RNAi-Fliegen mit den entsprechenden RNAi-Hintergrundstämmen bzw. WT-Fliegen gekreuzt. Alle Fliegen wurden bei 25 °C aufgezogen, mit Ausnahme der unten aufgeführten Ausnahmen zur Manipulation der RNAi-Expression. In allen Experimenten wurden Populationen von 2–8 Tage alten Fliegen verwendet.

Für Experimente zur Appetitkonditionierung wurden 80–100 Fliegen vor dem Training 19–22 Stunden lang in ein 25-ml-Fläschchen mit 1 % Agar (als Wasserquelle) und ein 20 × 60 mm großes Stück Filterpapier gegeben und ausgehungert das gesamte Experiment, außer bei der Untersuchung des 24-Stunden-Gedächtnisses, bei dem die Fliegen nach dem Training 30 Minuten lang gefüttert wurden und dann bis zum Test in Hungerfläschchen zurückgekehrt wurden. Für aversive Konditionierungsexperimente wurden 80–100 Fliegen vor Verhaltensexperimenten 14–22 Stunden lang in ein Fläschchen mit Standardfutter und einem Stück Filterpapier gegeben.

Für Experimente zur neuronalen Blockierung mit UAS-Shits1 ist in jeder Abbildung ein Schema der Zeitachse der Temperaturverschiebung dargestellt. Für Shits1-Experimente wurden die Fliegen vor dem Training und/oder dem Test 30 Minuten lang einer restriktiven Temperatur von 33 °C ausgesetzt. Für RNAi-Experimente mit tubP-GAL80ts;VT43924-GAL4.2 wurden Fliegen bei 18 °C gehalten und nach der Eklosion auf 29 °C umgestellt, um die RNAi-Expression drei Tage lang vor den Verhaltensexperimenten zu induzieren. Die Fliegen blieben für die Dauer der Experimente bei 29 °C.

Alle Verhaltensexperimente wurden unter Verwendung eines Standard-T-Labyrinths durchgeführt, das so modifiziert wurde, dass es die gleichzeitige Abgabe von Farb- und Geruchsreizen ermöglichte. Das aus durchsichtigem Kunststoff gefertigte T-Labyrinth wurde mit einer undurchsichtigen Verdunkelungsfolie abgedeckt, um Interferenzen zwischen den visuellen Reizen bei paralleler Nutzung zu minimieren. Die Gerüche waren MCH und OCT, verdünnt in Mineralöl (ca. 1:10−3 Verdünnung). Für die Farben sorgten Leuchtdioden (LEDs); grüne LEDs mit einer Wellenlänge von 530 ± 10 nm (PM2E-3LGE-SD, ProLight Opto) und blaue LEDs mit einer Wellenlänge von 465 ± 10 nm (PM2B-3LDE-SD, ProLight Opto). Vier LEDs wurden in einem Schaltkreis auf einem Kühlkörper montiert und sicher auf den Geruchsabgaberohren montiert. Die Intensitäten der LEDs wurden so angepasst, dass naive Fliegen keine phototaktische Präferenz zwischen den beleuchteten T-Labyrinth-Armen zeigten. Visuelle Reize wurden sowohl beim Training als auch beim Testen auf die gleiche Art und Weise und mit der gleichen Intensität präsentiert. Für Appetitexperimente wurden die Reagenzgläser mit Filterpapier ausgekleidet; Für aversive Experimente wurden die Prüfröhren mit nicht elektrifizierten Schockgittern ausgekleidet. Die Experimente wurden in einer Klimakammer durchgeführt, die auf die gewünschte Temperatur und 55–65 % relative Luftfeuchtigkeit eingestellt war. Die Fliegen wurden vor dem Training und den Tests unter rotem Licht gehandhabt.

Die Appetitkonditionierung wurde im Wesentlichen wie zuvor beschrieben durchgeführt67. Kurz gesagt, Fliegen wurden 2 Minuten lang den Reizen Y (YFarbe und/oder YOGeruch) ohne Verstärkung in einem Röhrchen mit trockenem Filterpapier (CS−), 30 Sekunden lang sauberer Luft und dann 2 Minuten lang den Reizen X (XFarbe und/oder) ausgesetzt XOdour) präsentiert mit 5,8 M Saccharose, getrocknet auf Filterpapier (CS+). Zur aversiven olfaktorischen Konditionierung17,18 wurden Fliegen 1 Minute lang Reizen X (XFarbe und/oder Mindestexposition gegenüber Reizen Y (YFarbe und/oder YOGeruch) ohne Verstärkung (CS−). Elektroschocks wurden mit einem Grass S48 Square Pulse Stimulator (Grass Technology) abgegeben. Bei den Schockgittern handelte es sich um die zuvor beschriebenen68. Sie bestehen aus verschachtelten Kupferreihen, die auf eine transparente Mylar-Folie gedruckt sind, die farbiges Licht durchlässt.

Die Gedächtnisleistung wurde bewertet, indem Fliegen 2 Minuten lang auf ihre Präferenz zwischen den CS−- und CS+-Farben und/oder -Gerüchen getestet wurden. Die Geruchsprüfung wurde im Dunkeln durchgeführt. Die Fliegen in jedem Arm wurden gesammelt und in Polystyrolröhrchen überführt (14-ml-Rundboden-Reagenzglas aus Polypropylen mit Deckel, Falcon). Röhrchen mit Fliegen wurden bei –20 °C eingefroren, die Fliegen wurden dann entfernt und manuell gezählt.

Leistungsindizes wurden als Anzahl der Fliegen im CS+-Arm minus der Anzahl im CS−-Arm, dividiert durch die Gesamtzahl der Fliegen, berechnet. Für alle Verhaltensexperimente stellt eine einzelne Probe oder n den durchschnittlichen Leistungsindex von zwei unabhängigen Gruppen von Fliegen dar, die mit den reziproken Farb-Geruch-Kombinationen CS+ und CS− trainiert wurden. Die Gesamtzahl n für jedes Experiment wurde über drei verschiedene Trainingseinheiten an verschiedenen Tagen ermittelt.

Es wurden sechs Verhaltensprotokolle verwendet:

Visuelles Lernen: Farben (XColor und YColor) wurden als CS+ und CS− verwendet.

Olfaktorisches Lernen: Gerüche (XOdour und YOdour) wurden als CS+ und CS− verwendet.

Kongruentes Protokoll: Farben und Gerüche wurden als CS+ und CS− kombiniert (XFarbe + XGeruch und YFarbe + YGeruch). Während des Trainings und Tests wurden die gleichen Farb- und Geruchskombinationen verwendet.

Inkongruentes Protokoll: Die Kontingenzen von Farb- und Geruchsreizen wurden zwischen Training (XFarbe + YOdour und YColor + XGeruch) und Testen (XFarbe + XGeruch und YFarbe + YOdour) gewechselt.

Die visuellen und olfaktorischen Lernprotokolle sind unsensorisch, wohingegen die kongruenten und inkongruenten Protokolle multisensorisch sind.

Geruchserkennung: Fliegen wurden wie im kongruenten Protokoll trainiert, beim Test wurden jedoch nur Gerüche (XOdour und YOdour) zur Auswahl angeboten.

Visuelles Abrufen: Fliegen wurden wie im kongruenten Protokoll trainiert, beim Test wurden jedoch nur Farben (XColor und YColor) zur Auswahl angeboten.

Die in Abb. 4f,g dargestellten sequentiellen Lernexperimente verwendeten aversives oder appetitliches kongruentes multisensorisches Training, gefolgt von unsensorischem appetitlichem oder aversivem olfaktorischem Lernen und anschließendem Testen mittels olfaktorischem Abruf.

Alle Fliegen wurden bei 25 °C aufgezogen und in allen Experimenten wurden 3–8 Tage alte männliche und weibliche Fliegen verwendet. Bildgebende Experimente wurden im Wesentlichen wie zuvor beschrieben durchgeführt69,70,71. Kurz gesagt, die Fliegen wurden im T-Labyrinth-Setup trainiert, indem entweder olfaktorisches Lernen (Protokoll 2), ein kongruentes multisensorisches Protokoll (Protokoll 3) oder ein ungepaartes Trainingsprotokoll verwendet wurde. Im ungepaarten Training wurden die Fliegen den kombinierten Geruchs- und visuellen Reizen (Kombination XFarbe + Nach dem Training wurden die Fliegen bis zur Aufzeichnung im Dunkeln gehalten. Kurz vor der Aufnahme wurden die Fliegen kurz auf Eis ruhiggestellt und in einer speziell angefertigten Kammer montiert, die eine freie Bewegung der Antennen und Beine ermöglichte. Die Kopfkapsel wurde unter einer carbogenierten Pufferlösung (95 % O2 und 5 % CO2) bei Raumtemperatur geöffnet und die Fliege in der Aufnahmekammer unter ein Zwei-Photonen-Mikroskop (Scientifica) gelegt. Für ausgehungerte Fliegen wurde der folgende zuckerfreie Puffer verwendet: 108 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM HEPES, 15 mM Ribose, 4 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2 und 8,2 mM MgCl2, Osmolarität 272 mOsm, pH 7.3). Für gefütterte Fliegen wurde der folgende Puffer verwendet: 103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM N-Tris, 10 mM Trehalose, 10 mM Glucose, 7 mM Saccharose, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 1,5 mM CaCl2 und 4 mM MgCl2 , Osmolarität 275 mOsm, pH 7,3).

Die Fliegen wurden einem konstanten Luftstrom ausgesetzt, der Dämpfe aus Mineralöllösungsmitteln (Luft) transportierte. Für geruchsinduzierte Bildgebungsexperimente wurden Fliegen nacheinander CS+- und CS−-Geruch ausgesetzt, jeweils für 5 s, unterbrochen von 30 s, um den Verhaltenstest zu simulieren. Wie in den Verhaltensexperimenten handelte es sich bei den Gerüchen um MCH und OCT (ca. 1:10−3 in Mineralöl verdünnt) und sie wurden reziprok als CS+ und CS− verwendet. Alle Fliegen, die nicht auf einen der beiden präsentierten Gerüche reagierten, wurden von weiteren Analysen ausgeschlossen. Für farbevozierte Bildgebungsexperimente wurde die Farbdarstellung mit der Bildaufnahme verschachtelt. Dies wurde durch einen Verschluss am Objektiv (Optischer Strahlverschluss mit Ø1/2" Edelstahlmembran und Controller, Thorlabs) und einen zweiten extern gesteuerten Verschluss (Vincent/UniBlitz VS35S2ZM1R1-21 Uni-Stable Shutter; UniBlitz VMM-T1 Shutter Driver/ Timer-Controller) auf dem LED-Abgabesystem. Für jeden Aufnahmezyklus wurde die Farbe 0,75 s lang bei 0,4 Hz präsentiert, gefolgt von einer Bildaufnahme für 1,75 s. Wichtig ist, dass die gepulste 0,4-Hz-Farbpräsentation bei naiven Fliegen robuste Reaktionen in γd-KCs hervorrief , gemessen mit UAS-ASAP2f (Extended Data Abb. 4h), und Verhaltensgedächtnistests mit 0,4 Hz flackernden Farben ergaben eine ähnliche Gedächtnisleistung wie die mit kontinuierlicher Farbdarstellung (Extended Data Abb. 4d, e). Wir verwendeten UAS-ASAP2s für γm-KC-Aufzeichnungen, da es langsamere und größere Reaktionen als ASAP2f erzeugt, was wir als vorteilhaft für die Verschachtelung der Bildaufnahme mit der Farbdarstellung betrachteten. Fliegen wurden nacheinander viermal der CS+-Farbe und dann viermal der CS−-Farbe ausgesetzt Auf jede Farbdarstellung folgt ein Bildaufnahmezyklus. Ein 30-s-Intervall trennte die CS+- und CS−-Aufzeichnungen. Blau und Grün wurden wechselseitig als CS+ und CS− verwendet. Eine Gehirnhälfte wurde zufällig ausgewählt, um KC-Axone abzubilden. Es ist selten möglich, alle MB-Kompartimente des γ-Lappens abzubilden, da γ1 und γ5 meist in unterschiedlichen Ebenen liegen. Wir mussten daher diese beiden Kompartimente unabhängig voneinander analysieren.

Die Fluoreszenz wurde mit etwa 140-fs-Impulsen und einer Wiederholungsrate von 80 MHz angeregt, die auf 910 nm zentriert waren und von einem Ti-Saphir-Laser (Chameleon Ultra II, Coherent) erzeugt wurden. Bilder mit 256 × 256 Pixeln wurden mit 5,92 Hz aufgenommen, gesteuert durch die ScanImage 3.8-Software72. Gerüche wurden mithilfe eines speziell entwickelten Systems73 abgegeben, das von LabView (v.11) gesteuert wurde.

Für die akute 5-HT-Anwendung verwendeten wir ein Perfusionspumpensystem (14-284-201, Fisher Scientific), um kontinuierlich Kochsalzlösung mit einer Rate von etwa 0,043 ml s−1 zuzuführen. 5-HT wurde in Gegenwart von 1 µM Tetrodotoxin angewendet, um spannungsgesteuerte Natriumkanäle und die Ausbreitung von Aktionspotentialen zu blockieren, die zu einer indirekten Anregung führen könnten. Um die Auswirkungen von Serotonin auf die γd-KC-Membranspannung zu untersuchen, wurde die Grundlinienfluoreszenz 5 Minuten lang aufgezeichnet, bevor für weitere 5 Minuten auf eine Lösung mit 100 μM Serotoninhydrochlorid (H9523, Sigma Aldrich) umgestellt wurde. Das Auswaschen wurde durchgeführt, indem die Lösung wieder auf Kochsalzlösung umgestellt wurde. Der Zeitpunkt der Anwendung und die Konzentration des verwendeten 5-HT sind vergleichbar mit neueren physiologischen Studien, in denen exogenes 5-HT auf das Gehirn von Drosophila angewendet wurde74,75,76,77. Aufgrund der Länge des Perfusionsschlauchs und des Totvolumens dauerte es etwa 70 s, bis der Perfusionsschalter das Gehirn erreichte.

Zur Analyse wurden Zwei-Photonen-Fluoreszenzbilder manuell mit Fiji78 segmentiert, wobei ein maßgeschneiderter Code einschließlich eines Bildstabilisierungs-Plugins79 verwendet wurde. Die Bewegung der Tiere war so gering, dass für die Bilder keine Registrierung erforderlich war. Für nachfolgende quantitative Analysen wurden benutzerdefinierte Fiji- und MATLAB-Skripte verwendet. Die Grundfluoreszenz F0 wurde für jede Reizreaktion als mittlere Fluoreszenz F von 2 s vor und bis zum Zeitpunkt der Geruchs- oder Farbpräsentation (oder 30 s nach Beginn der Aufzeichnungen für 5-HT-Behandlungen) definiert. −ΔF/F0 beschreibt dementsprechend die Fluoreszenz relativ zu dieser Basislinie. Für die durch Gerüche hervorgerufenen Reaktionen von KCs wurde die Fläche unter der Kurve als Integral von −ΔF/F0 während der 5-sekündigen Geruchsstimulation gemessen. Wir haben uns dafür entschieden, die natürlichen Einheiten des Experiments bei der Angabe der integrierten Fläche unter der Kurve beizubehalten (d. h. (−ΔF/F0) × (5 s)), da wir keine Rückschlüsse auf die Form der Reaktion ziehen. Für die farbbedingten KC-Reaktionen wurde das mittlere Fluoreszenzsignal (−ΔF/F0) für den ersten Erfassungszyklus (1,75 s) quantifiziert. Jedes n entspricht einer Aufnahme von einer anderen einzelnen Fliege. Alle Daten wurden über drei verschiedene Trainingseinheiten an verschiedenen Tagen erfasst.

Für 5-HT-Behandlungen haben wir die „Vorbehandlung“ als den mittleren −ΔF/F0-Wert für 300 s vor der 5-HT-Abgabe definiert, die 5-HT-Anwendung war der mittlere −ΔF/F0 für 300 s während 5-HT-Behandlungen. HT-Abgabe und „Washout“-Behandlung als Mittelwert −ΔF/F0 für 300 s ab Beginn der Arzneimittelabgabe. Die Spuren wurden über 5 s durch einen gleitenden Durchschnittsfilter geglättet. Jedes n entspricht einer Aufnahme von einer anderen einzelnen Fliege. Alle Daten wurden in drei verschiedenen Bildgebungssitzungen an verschiedenen Tagen erfasst.

ASAP2f- und ASAP2s-Daten werden als −ΔF/F0 dargestellt, um die umgekehrte Beziehung zwischen Sensorfluoreszenz und Membranspannung zu korrigieren.

Statistische Analysen wurden in GraphPad Prism durchgeführt. Alle Verhaltensdaten wurden mit einem ungepaarten zweiseitigen T-Test, einem Mann-Whitney-U-Test, einer einfaktoriellen ANOVA oder einem Kruskal-Wallis-H-Test analysiert, gefolgt von einem Post-hoc-Mehrfachvergleichstest nach Tukey, Dunnett oder Dunn. Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurden keine statistischen Methoden verwendet. Die Stichprobengrößen waren ähnlich wie bei anderen Veröffentlichungen auf diesem Gebiet. Für die Bildgebungsexperimente wurden geruchsbedingte Reaktionen durch einen gepaarten zweiseitigen t-Test für normalverteilte Daten und eine einfaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen verglichen, und für nicht-Gauß-verteilte Daten wurde ein Wilcoxon-Signed-Rank-Test verwendet. Die Normalität wurde mit dem D'Agostino- und Pearson-Normalitätstest getestet. Für Bilddaten wurde für jeden Datensatz eine Methode zur Ausreißeridentifizierung (ROUT-Methode) durchgeführt, die auf der Falscherkennungsrate basiert. Die Falscherkennungsrate wurde auf den höchstmöglichen Q-Wert (10 %) eingestellt. In Datensätzen, in denen potenzielle Ausreißer identifiziert wurden, wurden statistische Analysen durchgeführt, indem alle geruchsbedingten Reaktionen dieser Fliegen entfernt wurden. Die Analysen mit und ohne Ausreißer unterschieden sich nicht, daher haben wir uns entschieden, die vollständigen Datensätze beizubehalten und darzustellen, die potenzielle Ausreißer enthalten können. Zur Angabe der Effektgrößen wurde das partielle Eta-Quadrat verwendet (η2 = 0,01 weist auf einen kleinen Effekt hin; η2 = 0,06 weist auf einen mittleren Effekt hin; η2 = 0,14 weist auf einen großen Effekt hin); Die verwendete Formel wird in der Statistiktabelle angegeben. Alle statistischen Analysen werden auch in der Statistiktabelle in den Zusatzinformationen aufgeführt.

Die Experimente wurden randomisiert, wobei in jedem unabhängigen Experiment geeignete Kontrollen vorhanden waren. Alle getesteten und analysierten Genotypen wurden für den Experimentator selbst verblindet. Weitere Details zum Forschungsdesign finden Sie in der Berichtszusammenfassung.

Es wurden neuromorphologische Berechnungen und Konnektivitätsanalysen durchgeführt sowie Dendrogramme berechnet und aufgezeichnet, wobei Skripte auf NAVis 1.2.1-Bibliotheksfunktionen in Python 3.8.8 basierten (https://pypi.org/project/navis/; https://github. com/navis-org/navis)80 und Daten aus dem Drosophila-Halbhirn (v.1.2.1) (https://neuprint.janelia.org)32,33. Alle neuronalen Skelette wurden geheilt (navis.heal_skeleton (method = „ALL“, max_dist = „100 nanometer“, min_size = 10)), neu verwurzelt (navis.reroot_skeleton (x.soma)) und mit konservierten Konnektoren stark heruntergetastet (navis. downsample_neuron(downsampling_factor = 1000, Preserve_nodes = 'Connectors')).

3D-Darstellungen von Neuronen, die durch die Strahler-Ordnung schattiert wurden, wurden mit navis.plot2d (method='3d', Shade_by='strahler_index') generiert, nachdem Zweige mit einer Strahler-Ordnung von 1 oder weniger beschnitten wurden (navis.prune_by_strahler()). Gegebenenfalls wurden nur Zweige in bestimmten Volumes berücksichtigt (navis.in_volume()). Die Volumina wurden von neuprint (v.1.2.1) mit fetch_roi() abgerufen. Die Konnektivität wurde unter Verwendung ungekürzter Neuronen und mit Kompartimentspezifität (navis.in_volume()) analysiert.

Benutzerdefinierte Skripte basierend auf navis.plot_flat() wurden verwendet, um Dendrogramme von DPM- und APL-Neuronen mit beschnittenen Zweigen der Strahler-Ordnung von 1 oder weniger zu generieren. MB-Abteilungsgrenzen wurden durch Konnektivität zu DANs der jeweiligen Abteilungen definiert. Zweige außerhalb des γ-Lappens wurden manuell verkleinert, um die Sichtbarkeit der γ-Lappen-Kompartimente zu verbessern. Synapsen werden durch in_volume() gefiltert und auf Zweigen mit einer Strahler-Ordnung von mehr als 1 angezeigt. Die Konnektivitätsstatistiken basieren auf ungekürzten Neuronen, und Synapsen zwischen Neuronen wurden mit R-basiertem natverse:: neuprint_get_synapses() (https://natverse.org) ermittelt )80 Skripte erstellt und mit benutzerdefinierten Skripten in Python verarbeitet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind unter https://github.com/PJZO/Multisensory-learning-Engram.git verfügbar. Der im Abschnitt „Neuroanatomie, Konnektivität und Dendrogramme“ der Methoden erwähnte Datensatz für das Drosophila-Halbhirn ist öffentlich verfügbar unter https://neuprint.janelia.org.

Angepasste MATLAB- und Fiji/ImageJ-Skripte sind unter https://github.com/PJZO/Multisensory-learning-Engram.git verfügbar. Der im Abschnitt „Neuroanatomie, Konnektivität und Dendrogramme“ in den Methoden erwähnte Code ist öffentlich verfügbar unter https://pypi.org/project/navis/, https://github.com/navis-org/navis und https:/ /natverse.org.

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Referenzen herunterladen

Wir danken R. Brain, K. delos Santos, R. Busby, M. Moreno Gasulla, J.-P. Moszynski und F. Woods für technische Unterstützung; und G. Rubin, FlyLight, B. Dickson, A. Lin und das Vienna Drosophila Resource Center sowie das Bloomington Stock Centre für Fliegen. ZO wurde durch ein EMBO-Langzeit-Postdoktorandenstipendium (ALTF 311-2017) finanziert. PV-G. wurde durch das Sloane Robinson/Clarendon-Stipendium des Clarendon Fund-Programms der Universität und des Keble College sowie vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) finanziert. SW wurde durch ein Wellcome Principal Research Fellowship (200846), einen Wellcome Discovery Award (225192), einen ERC Advanced Grant (789274) und Wellcome Collaborative Awards (203261 und 209235) finanziert.

Nils Otto

Present address: Institute of Anatomy and Molecular Neurobiology, Westfälische Wilhelms-Universität Münster, Münster, Germany

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Zeynep Okray, Pedro F. Jacob

Zentrum für neuronale Schaltkreise und Verhalten, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Zeynep Okray, Peter F. Jacob, Ciara Stern, Kieran Desmond, Nils Otto, Clifford B. Talbot, Paola Vargas-Gutierrez und Scott Waddell

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ZO, PFJ, CBT und SW haben die Forschung entworfen. ZO, PFJ, CS, KD, NO und PV-G. führte die Experimente durch. ZO, PFJ, CS, KD und NO analysierten die Daten. SW stellte Ressourcen zur Verfügung. SW, ZO, PFJ und NO haben das Manuskript geschrieben. SW betreute die Studie. SW und ZO haben Fördermittel eingeworben.

Korrespondenz mit Zeynep Okray oder Scott Waddell.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

A. Oben links: multisensorische Protokolle. Grüne und blaue Quadrate stehen für Farben, hell- und dunkelgraue Quadrate für OCT- und MCH-Gerüche. Visuelles (V) Lernen: Farben werden als CS+ und CS− verwendet. Olfaktorisches (O) Lernen: Gerüche werden als CS+ und CS− verwendet. Kongruentes (C) Protokoll: Farben+Gerüche wurden als CS+ und CS− kombiniert. Dieselben Farb- und Geruchskombinationen, die während des Trainings und Tests verwendet wurden. Inkongruentes (I) Protokoll: Farben+Gerüche wurden als CS+ und CS− kombiniert, die Kombinationen wurden jedoch zwischen Training und Test vertauscht. Unten links: Trainings- und Testzeitleiste. Rechts, 24-Stunden-Speicherleistung für die Protokolle V, O, C und I. Die Kombination von Farben und Gerüchen im kongruenten (C)-Protokoll verbesserte die 24-Stunden-Leistung im Vergleich zu der Leistung, die mit unsensorischem V- oder O-Lernen erzielt wurde. Inkongruente (I) Paarung von Farben und Gerüchen machte die multisensorische Verbesserung des 24-Stunden-Gedächtnisses zunichte. B. Links, Trainings- und Testzeitleiste. Mittlere, multisensorische Protokolle. Richtig, sofortige Gedächtnisleistung. Fliegen zeigten nach dem C-Protokoll ein deutlich höheres Gedächtnis als nach dem I-Protokoll. C. Links, Trainings- und Testzeitleiste. Mittlere, multisensorische Protokolle: C-Protokoll wie oben beschrieben; Kongruentes Protokoll unter Verwendung derselben Farbe (C−sc) kombiniert mit unterschiedlichen Gerüchen wie CS+ und CS− während Training und Tests. Richtig, das C-Protokoll, das unterschiedliche Farb- und Geruchskombinationen für CS+ vs. CS− verwendet, führte zu einer höheren unmittelbaren Gedächtnisleistung als das C-sc-Protokoll, das dieselbe Farbe mit beiden Gerüchen verwendete. D. Links, Trainings- und Testzeitleiste. Mittlere, multisensorische Protokolle: Olfaktorisches (O) Lernen wie oben beschrieben; Multisensorische Retrieval (MSR): Die Gerüche waren während des Trainings CS+ und CS− und diese gleichen Gerüche wurden während des Tests mit verschiedenen Farben kombiniert. Richtig, die durch MSR hervorgerufene unmittelbare Gedächtnisleistung wurde nicht wesentlich auf die folgende Leistung beim olfaktorischen Lernen und Abrufen reduziert. e. Links, Trainings- und Testzeitleiste. Mittlere, multisensorische Protokolle: Kongruentes (C) Protokoll wie oben beschrieben; Geruchserkennung (OR): Farben+Gerüche waren während des Trainings CS+ und CS− und während des Tests wurden nur Gerüche verwendet. Richtig, Fliegen, die mit multisensorischen Reizen trainiert wurden, schnitten besser ab, wenn sie mit kongruenten multisensorischen Reizen getestet wurden, verglichen mit nur einer Modalität (in diesem Fall Geruch). Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede (P < 0,05). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Einzelne als Punkte dargestellte Datenpunkte entsprechen unabhängigen Experimenten. Die Gruppen wurden unter Verwendung der einfaktoriellen ANOVA mit dem Tukey-Test (a), dem ungepaarten zweiseitigen t-Test (b, c, e) und dem ungepaarten zweiseitigen Mann-Whitney-U-Test (d) verglichen. Es werden genaue P-Werte und Vergleiche angegeben in den Zusatzinformationen. N Werte für jedes Experiment sind: a, b, e, n = 10; c, n = 8; d, n = 10 für OR und n = 8 für MSR.

A. Oben links, schematische Darstellung von γd-KCs. Unten links: Trainings- und Testzeitleiste mit konstanter restriktiver Temperatur (gestrichelte Linie). Rechts, 6 Stunden lang bleibt die Gedächtnisleistung nach dem olfaktorischen Lernen unverändert, wenn γd-KCs durch das Experiment mit MB607B-GAL4 blockiert werden; UAS-Shits1 b und c. Das Blockieren von γd-KCs während des gesamten Experiments beeinträchtigte das Gedächtnis im Kongruent-Protokoll (b) erheblich. Die Befreiung von der Interferenzwirkung des Inkongruent-Protokolls erreichte keine Signifikanz (c). D. Oben links, schematische Darstellung von αβp-KCs. Unten links: Trainings- und Testzeitleiste mit konstanter restriktiver Temperatur (gestrichelte Linie). Rechts: Blockierung der αβp-KC-Ausgabe während des gesamten Experiments unter Verwendung von c708a-GAL4; UAS-Shits1 beeinträchtigte das olfaktorische Lernen nach 6 Stunden nicht. e und f. Die Gedächtnisleistung für die Protokolle Kongruent (e) und Inkongruent (f) änderte sich erheblich, wenn αβp-KCs während des Experiments blockiert wurden. g und h. Oben, Trainings- und Testzeitleiste mit Temperaturverschiebung (gestrichelte Linie). Das Blockieren von γd (g) und αβp (h) KCs beeinträchtigte das mit visuellen Hinweisen abgerufene Gedächtnis. ich. Oben links, schematische Darstellung von γd-KCs. Oben rechts, Trainings- und Testzeitleiste mit konstanter zulässiger Temperatur (gestrichelte Linie). il Speicherleistung im MB607B-GAL4; Das Fliegen von UAS-Shits1 nach den Protokollen Kongruent (i), Inkongruent (j), Olfaktorisches Abrufen (k) und Visuelles Abrufen (l) wurde nicht beeinträchtigt, als das Training und die Tests bei 23 °C durchgeführt wurden. M. Oben links, schematische Darstellung von αβp-KCs. Unten links: Trainings- und Testzeitleiste mit konstanter zulässiger Temperatur (gestrichelte Linie). mo Speicherleistung in c708a-GAL4; UAS-Shits1 fliegt nach den Protokollen „Kongruent“ (m), „Inkongruent“ (n) und „Visual Retrieval“ (o), was beim Training und Testen bei 23 °C nicht beeinträchtigt wurde. Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede (P < 0,05). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Einzelne als Punkte dargestellte Datenpunkte entsprechen unabhängigen Experimenten. Die Gruppen wurden unter Verwendung der einfaktoriellen ANOVA mit dem Tukey-Test (ag, io) und dem Kruskal-Wallis-H-Test mit dem Dunn-Test (h) verglichen. Die genauen P-Werte und Vergleiche finden Sie in den Zusatzinformationen. N-Werte für jedes Experiment sind: a-c, g, h, n = 12; d, n = 12 für c708a und n = 10 für alle anderen Gruppen, f, n = 10; io, n = 8.

A und B. Oben links: ungepaartes Appetittraining und Geruchsbildgebungsprotokoll. Die Darstellung von Farbe und Geruch war nicht vom Zucker abhängig. Unten links: Abbildungsebene im γ5-Bereich (a) und γ1 (b) von γd-KCs. Mitte: Spuren von CS+- und CS−-geruchsbedingter Aktivität. In beiden Regionen von γd-KCs verändert ungepaartes multisensorisches Appetittraining die Geruchsreaktionen nicht. Richtig, Quantifizierung der durch Gerüche hervorgerufenen Reaktionen. C. Farbbedingte Reaktionen (blau, grün und Kontrolle, dh LED aus) in der γ5-Region von γd-KCs bei naiven Fliegen. Während der Farbdarstellung wird die Bildaufnahme unterbrochen. Rechts zeigt die Quantifizierung erregende Reaktionen auf blaues, grünes Licht und Kontrolle (LED aus). d und e. Die gepulste Abgabe von farbigem Licht hat keinen Einfluss auf die multisensorische Gedächtnisleistung im Kongruent-Protokoll (d) oder im visuellen Abruf (e) nach multisensorischem Lernen. Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede (P < 0,05). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Einzelne als Punkte dargestellte Datenpunkte entsprechen unabhängigen Experimenten. f und g. Oben links: appetitive multisensorische (Farbe+Geruch, f) und unsensorische (Geruch, g) Trainings- und Geruchsbildgebungszeitpläne. Unten links: Bildebene in γd-KC-Somata. Mitte: Spuren von CS+- und CS−-geruchsbedingter Aktivität. Hemmende Reaktionen auf CS+- und CS−-Gerüche (Abnahme von −ΔF/F0) waren nach beiden Paradigmen offensichtlich. Richtig, Quantifizierung. h und ich. Oben links: Zeitpläne für appetitives multisensorisches (Farbe+Geruch)-Training und Geruchsbildgebung. Unten links: Abbildungsebene in den Regionen γ5 (h) und γ1 (i) von γm-KCs. Mitte: Spuren von CS+- und CS−-geruchsbedingter Aktivität. Sowohl die γ1- als auch die γ5-Region von γm-KCs zeigen eine Anregung für CS+- und CS−-Gerüche (Anstieg von −ΔF/F0). Richtig, Quantifizierung. Für alle Spuren und Quantifizierungen umfasste die CS+- und CS−-Präsentation wie in allen anderen Experimenten einen 50:50-Wechsel der Gerüche. Geruchs- oder farbbedingte Aktivitätsspuren zeigen den Mittelwert (durchgezogene Linie) mit dem SEM (Schatten). Horizontale gestrichelte Linien zeigen die Grundaktivität an. Die schwarze Linie unter den Spuren markiert die Geruchsexposition von 5 Sekunden. In (c) entspricht der graue vertikale Balken den 0,75 s der Farbpräsentation (bei geschlossener Bildaufnahme) und das Kästchen dem Zeitraum (1,75 s) der Quantifizierung. Sternchen kennzeichnen einen signifikanten Unterschied zwischen den durchschnittlichen CS+- und CS−-Antworten (P < 0,05). CS+- und CS−-Antworten für jede einzelne Fliege, verbunden durch eine gestrichelte Linie. Gruppen verglichen mit gepaartem zweiseitigem t-Test (a,b, fi), t-Test bei einer Stichprobe (c), einfaktorieller ANOVA mit Tukey-Test (d) und ungepaartem zweiseitigem t-Test (e) Genaue P-Werte und Vergleiche finden Sie in den Zusatzinformationen. N-Werte für jedes Experiment sind: a, b, n = 20 Fliegen; c, n = 20 Fliegen für Grün, n = 20 Fliegen für Blau, n = 6 für LED aus; d, e, n = 8; f, g, n = 22 Fliegen; h, i, n = 16 Fliegen.

A. Top, aversiver Trainings- und Testzeitplan. Unten, multisensorische Versuchsbedingungen. Grüne und blaue Quadrate stehen für Farben, helles und dunkles Grau für OCT- und MCH-Gerüche. Visuelles (V) Lernen; Olfaktorisches (O) Lernen; Kongruentes (C) Protokoll; Inkongruentes (I) Protokoll; Olfaktorische Retrieval (OR); Visuelles Abrufen (VR). bd. Top-, Trainings- und Testzeitpläne. Unten: Das aversive Gedächtnis war beim C-Protokoll sowohl unmittelbar (b) als auch 3 Stunden (c) nach dem Training signifikant gegenüber dem I-Protokoll erhöht. Fliegen im C-Protokoll übertrafen die getesteten Fliegen 3 Stunden nach dem Olfaktorischen (O)-Lernen. Nur das C-Protokoll generierte eine signifikante 24-Stunden-Speicherleistung (d). e und f. Top-, Trainings- und Testzeitpläne. Unten: Bei sofortigem Test (e) war das mit Farben abgerufene multisensorische Gedächtnis (VR) deutlich besser als das nach unsensorischem visuellem Lernen (V). Nach 3 Stunden (f) schnitten multisensorisch trainierte Fliegen deutlich besser ab, wenn ihr Gedächtnis nur mit olfaktorischen (OR) oder visuellen (VR) Hinweisen abgerufen wurde, als Fliegen, die mit unsensorischem olfaktorischen (O) oder visuellen (V) Lernen trainiert wurden. G. Oben links, schematische Darstellung von γd-KCs. Unten links: Trainings- und Testzeitleiste mit Temperaturverschiebung (gestrichelte Linie). gi. Blockieren der Ausgabe von γd-KCs während des Tests mit MB607B-GAL4; UAS-Shits1 verändert die 3-Stunden-Gedächtnisleistung in den Protokollen Kongruent (g), Inkongruent (h) und Olfaktorischer Abruf (i). J. Oben links, schematische Darstellung von γd-KCs. Unten links: Trainings- und Testzeitleiste mit konstanter zulässiger Temperatur (gestrichelte Linie). jl Speicherleistung in MB607B-GAL4; UAS-Shits1-Fliegen nach den Protokollen Kongruent (j), Inkongruent (k) und Geruchserkennung (l) wurden nicht beeinträchtigt, als die Fliegen bei 23 °C trainiert und getestet wurden. Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede (P < 0,05). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Einzelne als Punkte dargestellte Datenpunkte entsprechen unabhängigen Experimenten. m und n. Oben links: unsensorisches aversives Training und Geruchsbildgebungsprotokoll. Unten links, Abbildungsebene im γ1-Bereich (m) und γ5 (n) von γd-KCs. Mitte: Spuren von CS+- und CS−-geruchsbedingter Aktivität. Ein sensorisches aversives Training verändert die Geruchsreaktionen in keiner der γd-KC-Regionen. Richtig, Quantifizierung. o und p. Oben links: ungepaartes aversives multisensorisches Trainings- und Geruchsbildgebungsprotokoll. Die Farb- und Geruchsdarstellung war nicht auf einen Schock zurückzuführen. Unten links: Abbildungsebene im γ1-Bereich (o) und γ5 (p) von γd-KCs. Mitte: Spuren von CS+- und CS−-geruchsbedingter Aktivität. Ungepaartes multisensorisches aversives Training verändert die Geruchsreaktionen in keiner der γd-KC-Regionen. Richtig, Quantifizierung. Für alle Spuren und Quantifizierungen umfasste die CS+- und CS−-Präsentation wie in allen anderen Experimenten einen 50:50-Wechsel der Gerüche. Geruchsbedingte Aktivitätsspuren zeigen den Mittelwert (durchgezogene Linie) mit dem SEM (Schatten). Horizontale gestrichelte Linien zeigen die Grundaktivität an. Die schwarze Linie unter den Spuren markiert die Geruchsexposition von 5 Sekunden. Sternchen kennzeichnen einen signifikanten Unterschied zwischen den durchschnittlichen CS+- und CS−-Antworten (P < 0,05). CS+- und CS−-Antworten für jede einzelne Fliege, verbunden durch eine gestrichelte Linie. Die Gruppen wurden unter Verwendung der einfaktoriellen ANOVA mit dem Tukey-Test (bd, gl), dem ungepaarten zweiseitigen t-Test (e, f) und dem gepaarten zweiseitigen t-Test (mp) verglichen. Die genauen P-Werte und Vergleiche sind in der Ergänzung angegeben Information. N-Werte für jedes Experiment sind: b, g, il, n = 8; c, e, f, h, n = 10; d, n = 12; m, n, n = 22 Fliegen; o, p, n = 24 Fliegen.

A. Eine zweidimensionale Dendrogrammprojektion von DPM-Neuronneuriten (Blaugrüntöne). Der dorsale Ast der γ2-γ5-Kompartimente des horizontalen Lappens ist dunkelblaugrün, der Rest der γ-Lappenvorsprünge ist mittelblaugrün und die in den anderen Lappen sind heller blaugrün. Hinweis: Alle außer γ-Lappenneuriten sind zur besseren Sichtbarkeit verkleinert. Neuriten mit Strahler-Ordnung <1 werden beschnitten und die Konnektivität wird entsprechend angezeigt. Vorsprünge im γ1-Kompartiment sind markiert und im γ2-5-Kompartiment in dorsale und ventrale Äste aufgeteilt. Die Kennzeichnung erfolgt nach DAN-Konnektivität (schattierte Bereiche). Synapsen (Kugeln) sind nur in den γ-Lappenkompartimenten markiert. Die Konnektivitätsstruktur zeigt, dass Eingaben von γd-KCs (gelbe Kugeln) und Ausgaben von γm-KCs (graue Kugeln) auf kompartimentspezifischen Zweigen der DPM-Neuronen kolokalisieren. APL-Eingaben (magenta) werden über die dorsalen und ventralen Zweige verteilt und um den Verzweigungspunkt an der Basis der vertikalen Lappen im α′1-Kompartiment (Sternchen) konzentriert. Hinweis: Einige mutmaßliche Teile des dorsalen γ-Lappenzweigs konnten aufgrund fehlender DAN-Eingabe keinem Kompartiment zugeordnet werden. Ein Zweig, der γ-KC-Synapsen trägt (Hashtag), wurde als der β′-Lappenzweig identifiziert, der nahe der Mittellinie in den MB eintritt. Es ist wahrscheinlich, dass andere DPM-Neuritenspitzen, die über γ-KC-Synapsen verfügen, Artefakte sind, bei denen die Heilung frei schwebende γ-Lappenzweige mit DPM-Neuriten verschmolzen hat, die die anderen Lappen innervieren. B. Eine zweidimensionale Dendrogrammprojektion von APL-Neuronneuriten (Magenta). Hinweis: Neuriten mit Strahler-Ordnung <1 wurden beschnitten und die Konnektivität wird entsprechend angezeigt. Vergleiche mit (a). PPL1-γ1pedc- und PAM-γ5-DAN-Eingangssynapsen (rote bzw. grüne Kugeln) sind in den Kompartimenten γ1 und γ5 (schattierte Bereiche) markiert. Synapsen zu DPM-Neuronen (blaugrüne Kugeln) kolokalisieren mit DAN-Eingabe.

A und B. Oben: Anatomie des APL-Neurons. Trainings- und Testzeitpläne mit konstanter restriktiver Temperatur (gestrichelte Linie). Unten: Der auf Erwachsene beschränkte RNAi-Knockdown von Dop2R in APL-Neuronen unter Verwendung von tubPGAL80ts;VT43924-GAL4.2 beeinträchtigte die Leistung des olfaktorischen Retrievals nach 6 Stunden nach multisensorischem Appetittraining (a) und reduzierte das Gedächtnis nach unsensorischem olfaktorischem Lernen (b). c und d. Kontrollexperimente mit zulässiger Temperatur (23 °C) für (a) und (b). Oben, Trainings- und Testzeitleisten mit Temperaturverschiebung (gestrichelte Linie). Die Gedächtnisleistung blieb bei tubPGAL80ts;VT43924-GAL4.2, UAS-Dop2R RNAi-Fliegen nach dem Olfaktorischen Abrufen (c) und dem Riechlernen (d) unbeeinträchtigt, als die Fliegen bei 23 °C aufgezogen, trainiert und getestet wurden. e und f. Oben, Trainings- und Testzeitleisten mit Temperatur (gestrichelte Linie). Unten, 6 Stunden olfaktorischer Abruf des appetitlichen multisensorischen Gedächtnisses (e) und des Gedächtnisses nach olfaktorischem Lernen (f) wurde durch den auf Erwachsene beschränkten RNAi-Knockdown von DopEcR in APL-Neuronen unter Verwendung von tubPGAL80ts nicht beeinträchtigt; VT43924-GAL4.2. Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede (P < 0,05). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Einzelne als Punkte dargestellte Datenpunkte entsprechen unabhängigen Experimenten. Alle Gruppen wurden unter Verwendung der einfaktoriellen ANOVA mit dem Tukey-Test verglichen. Die genauen P-Werte und Vergleiche finden Sie in den Zusatzinformationen. N Werte für jedes Experiment sind: a, b, n = 12; c, d, n = 8; e, f, n = 10.

A. Kontrollexperiment mit zulässiger Temperatur (23 °C) für Abb. 5c,d. Top, Trainings- und Testzeitplan. Unten: Multisensorische Gedächtnisleistung, hervorgerufen durch Olfactory Retrieval von VT64246-GAL4; UAS-Shits1-Fliegen blieben unbeeinträchtigt, als die Fliegen bei 23 °C trainiert und getestet wurden. B. Oben, Trainings- und Testzeitleiste mit Temperaturverschiebung (gestrichelte Linie). Unten: Die Blockierung der Ausgabe von DPM-Neuronen während des Tests beeinträchtigte den visuellen Abruf des multisensorischen Gedächtnisses. C. Kontrollexperiment mit zulässiger Temperatur (23 °C) für erweiterte Daten, Abb. 7b. Top, Trainings- und Testzeitplan. Unten: Multisensorische Gedächtnisleistung, hervorgerufen durch Visual Retrieval von VT64246-GAL4; UAS-Shits1-Fliegen blieben unbeeinträchtigt, als die Fliegen bei 23 °C trainiert und getestet wurden. D. Oben, Trainings- und Testzeitleiste mit Temperaturverschiebung (gestrichelte Linie). Unten: Das Blockieren der Ausgabe von DPM-Neuronen während des unsensorischen Trainings und Tests hatte keinen Einfluss auf die olfaktorische Lernleistung. e. Oben links, schematische Darstellung von γ-KCs. z.B. Oben, Trainings- und Testzeitleiste mit Temperaturverschiebung (gestrichelte Linie). Unten: Blockierung der Ausgabe von γ-KCs während des Trainings mit MB009B-GAL4; UAS-Shits1 hatte keinen Einfluss auf die olfaktorische Lernleistung (e) über 6 Stunden, während die Gedächtnisleistung beim olfaktorischen Abruf (f) und beim visuellen Abruf (g) deutlich beeinträchtigt war. h und ich. Kontrollexperimente mit zulässiger Temperatur (23 °C) für erweiterte Daten, Abb. 7f, g. Top-, Trainings- und Testzeitpläne. Unten: Multisensorische Gedächtnisleistung, hervorgerufen durch Olfactory Retrieval (h) oder Visual Retrieval (i) von MB009B-GAL4; UAS-Shits1-Fliegen blieben unbeeinträchtigt, als die Fliegen bei 23 °C trainiert und getestet wurden. j und k. Links: Zeitplan für appetitives unisensorisches (Geruchs-)Training und Geruchsbildgebung. Bildebenen in den Regionen γ5 (j) und γ1 (k) des DPM-Neurons. Richtig, Quantifizierung. 6 Stunden nach dem Geruchstraining zeigten die Regionen γ5 (j) und γ1 (k) von DPM-Neuronen nicht unterscheidbare erregende Reaktionen sowohl auf CS+- als auch auf CS−-Gerüche. k und l. Top, appetitliches multisensorisches (Farbe+Geruch) oder unisensorisches (Geruch) Training und Zeitpläne für die Geruchsdarstellung. Bildebene in der γ5-Region von DPM-Neuronen. Unten zeigte die Quantifizierung der γ5-Reaktionen von DPM-Neuronen 1 Stunde nach dem multisensorischen (l) und unisensorischen (m) Training eine verstärkte erregende Reaktion auf die Gerüche CS+ gegenüber den Gerüchen CS−. n und o. Top, appetitliches multisensorisches (Farbe+Geruch) oder unisensorisches (Geruch) Training und Zeitpläne für die Geruchsdarstellung. Bildebene in der γ1-Region des DPM-Neurons. Unten zeigte die Quantifizierung der γ1-Reaktionen von DPM-Neuronen 1 Stunde nach dem multisensorischen (n) und unisensorischen (o) Training keinen Unterschied zwischen den erregenden Reaktionen auf die CS+- und CS−-Gerüche. p und q. Oben: Abbildungsebene im γ1 (p)- und γ5 (q)-Bereich von γd-KCs. Unten links: Eine Grundlinienaufzeichnung in Kochsalzlösung (300 s; nicht gezeigt), gefolgt von einer Perfusion von 100 μM 5-HT für 300 s und anschließendem Auswaschen in Kochsalzlösung für 300 s. Dargestellt sind durchschnittliche Spuren für Badanwendung und Auswaschen. Rechts zeigt die Quantifizierung erregende Reaktionen auf die 5-HT-Anwendung in beiden Regionen (erhöhter Mittelwert –ΔF/F0) im Vergleich zum Ausgangswert (vor) und nach dem Auswaschen. R. Oben links, schematische Darstellung von γd-KCs. Unten links: Trainings- und Testzeitleiste. Rechts, die olfaktorische Lernleistung nach 6 Stunden bleibt bei Fliegen durch den RNAi-Knockdown von 5-HT2A mit MB607B-GAL4 unbeeinträchtigt. Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede (P < 0,05). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Einzelne als Punkte dargestellte Datenpunkte entsprechen unabhängigen Experimenten. S. Links: Zeitleiste für appetitliches multisensorisches Training (Farbe + Geruch) und Farbbildgebung. Bildebene in der γ5-Region von γd-KC-Axonen. Mitte: Spuren von CS+- und CS−-farbbedingter Aktivität. Die γ5-Region der γd-KC-Axone zeigte erregende Reaktionen sowohl auf CS+- als auch auf CS−-Farben. Rechts, Quantifizierung farbbedingter Reaktionen. Für Spuren in (s) und alle Quantifizierungen umfasste die CS+- und CS–-Präsentation wie in allen anderen Experimenten einen 50:50-Wechsel der Gerüche und/oder Farben. Farbbedingte Aktivitätsspuren zeigen den Mittelwert (durchgezogene Linie) mit dem SEM (Schatten). In (s) entspricht der vertikale graue Balken der Farbdarstellung von 0,75 s (bei geschlossener Bildaufnahme) und das Kästchen dem Quantifizierungszeitraum von 1,75 s. Horizontale gestrichelte Linien zeigen die Grundaktivität an. Sternchen kennzeichnen einen signifikanten Unterschied zwischen den durchschnittlichen CS+- und CS−-Antworten (P < 0,05). CS+- und CS−-Antworten für jede einzelne Fliege, verbunden durch eine gestrichelte Linie. Die Gruppen verglichen die Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Tukey-Test (ae, gi, r), dem Kruskal-Wallis-H-Test mit dem Dunn-Test (f), einem gepaarten zweiseitigen t-Test (jo, s) und wiederholten einfaktoriellen Messungen ANOVA mit Tukey-Test (p,q), genaue P-Werte und Vergleiche finden Sie in den Zusatzinformationen. N-Werte für jedes Experiment sind: ac, r, n = 8; d, n = 12; ei, n = 8; j, k, n, n = 18 Fliegen; l, m, o, s, n = 16 Fliegen; o, p, n = 10.

n-Werte, deskriptive Statistiken und statistische Analysen mit genauen P-Werten für Abb. 1–5.

n-Werte, deskriptive Statistiken und statistische Analysen mit genauen P-Werten für Extended Data Abb. 1–7.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Okray, Z., Jacob, PF, Stern, C. et al. Multisensorisches Lernen bindet Neuronen in ein modalübergreifendes Gedächtnis-Engramm. Natur 617, 777–784 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06013-8

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Eingegangen: 07. Juli 2022

Angenommen: 24. März 2023

Veröffentlicht: 26. April 2023

Ausgabedatum: 25. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06013-8

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