Nutzung der Peroxidase

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 6953 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Mit Polyvinylpyrrolidon stabilisierte Silbernanopartikel (PV-AgNPs) wurden aus AgNO3/Trinatriumcitrat und mit Hilfe von Mikrowellenenergie synthetisiert. Es wurde festgestellt, dass die synthetisierten PV-AgNPs tatsächlich eine Peroxidase-nachahmende Aktivität besitzen. Diese katalytische Aktivität kann das nicht fluoreszierende Reagens (o-Phenylendiamin) zu einem stark fluoreszierenden Reaktionsprodukt (2,3-Diaminophenazin) oxidieren. Das Reaktionsprodukt zeigte bei Anregung bei 420 eine Fluoreszenzemission bei 563 nm. Unter vielen Metallen können nur Quecksilber(II)-Ionen die katalytische Aktivität von PV-AgNPs-Nanozym hemmen. Dementsprechend wurde die Fluoreszenzintensität des Reaktionsprodukts erfolgreich gelöscht. Dieser Löscheffekt in der Fluoreszenzintensität war direkt proportional zur Konzentration von Quecksilber (II). Basierend auf dieser Erkenntnis wurde ein einfacher, kostengünstiger und selektiver spektrofluorimetrischer Ansatz für den Nachweis von Quecksilber (II) in Wasserproben entwickelt. Der lineare Zusammenhang zwischen der Hemmung der Fluoreszenzintensität und der Quecksilber(II)-Konzentration wurde bei 20–2000 nM mit einer Nachweisgrenze von 8,9 nM gefunden.

Quecksilbermetall ist eines der bekanntesten giftigen und am weitesten verbreiteten Schwermetalle, da es bei Anreicherung im menschlichen Körper schädliche Auswirkungen hat1. Es wird durch menschliche Aktivitäten und Naturphänomene weit verbreitet im Boden, in der Atmosphäre und im Meerwasser verteilt und verursacht schwerwiegende Folgen für die meisten lebenden Organismen und die Umwelt2. Die Hauptquellen für die Verunreinigung von Oberflächengewässern und Abwässern durch Quecksilber (II) sind die Chloralkaliproduktion, Papier und Zellstoff, Ölraffinerien, Batterien und Farbenherstellungsprozesse in der Industrie3. Aufgrund seiner hohen Affinität zu Thiolgruppen, die in Enzymen und Proteinen vorkommen, kann sich Quecksilber in menschlichen Körpergeweben und lebenswichtigen Organen ansammeln und bereits in geringen Mengen giftige Stoffe erzeugen und die menschliche Gesundheit schädigen4. Einige chronische und akute Symptome und Anzeichen, die durch die anorganische Quecksilbertoxizität hervorgerufen werden, sind wie folgt: Mundentzündung; Durst; metallischer Geschmack; Brechreiz; übermäßiger Speichelfluss; Nierendegeneration und Zittern5.

Die Selektivität und Empfindlichkeit der verwendeten Chemosensorik zum Nachweis von Quecksilber(II)-Ionen in Wasserproben ist eine wesentliche Anforderung. Daher sollte sich der verwendete Sensor durch Einfachheit, niedrige Kosten, hohe Empfindlichkeit und ausreichende Selektivität auszeichnen und Quecksilber(II)-Ionen in wässrigen Proben im nanomolaren Bereich und ohne Störungen durch das Vorhandensein anderer Metallionen erfassen können.

Nanopartikel werden häufig als Sensoren zur Erkennung von Umweltschadstoffen eingesetzt6,7,8,9. Viele Forscher sind aufgrund ihrer ungewöhnlichen optischen Eigenschaften, ihres SPR-Bandes und ihrer ultrakleinen Größe an Silbernanopartikeln interessiert10,11,12,13. Silbernanopartikel werden aufgrund ihrer hervorragenden Leitfähigkeit und katalytischen Aktivität auch häufig in der Sensorik, der Textilindustrie und der Lebensmittellagerung eingesetzt10,11,12,13,14,15. Die charakteristische, einzigartige enzymähnliche Aktivität von Metallnanopartikeln hat das Interesse an der Katalyse zahlreicher chemischer Reaktionen und Metallanalyseanwendungen geweckt16.

Es gibt viele Vorteile für die Verwendung von Nanopartikeln als Enzymnachahmer/künstliche Enzyme gegenüber natürlichen Enzymen, bei denen der Schwerpunkt auf der Abwesenheit der inhärenten Hindernisse des natürlichen Enzyms liegt. Zu diesen Hindernissen gehören zeitaufwändige, langwierige Verfügbarkeit natürlicher Ressourcen und kostspielige Reinigungsverfahren; Empfindlichkeit gegenüber erhöhten Temperaturen, strengen Lagerbedingungen, Empfindlichkeit gegenüber alkalischen und sauren pH-Werten und Proteasen, was zu einer verminderten Stabilität und damit zu einer Verkürzung der Haltbarkeitsdauer führt17,18. Enzyme imitieren anorganische Nanopartikel und weisen einige Merkmale auf, darunter niedrige Kosten, hohe Stabilität, Beständigkeit gegenüber hohen Konzentrationen des Substrats, einfache Lagerung und einfache Synthese19,20,21.

Im Allgemeinen weisen Nanopartikel aus Edelmetallen (wie Gold, Silber, Platin und Palladium) ansprechende physikalisch-chemische Eigenschaften auf, die von ihrer Form und Größe abhängen6,16. Beispielsweise wurde die Peroxidase-ähnliche katalytische Aktivität von Goldnanopartikeln für die kolorimetrische Erfassung von Quecksilber(II)- und Bleiionen in Wasserproben genutzt22,23. Darüber hinaus wurde die katalytische Aktivität von Platin-Nanopartikeln zum Nachweis von Quecksilber(II)-Ionen in Wasserproben genutzt24,25. Außerdem wurde die katalytische Aktivität von Silbernanopartikeln für den visuellen kolorimetrischen Nachweis von Proteinen und als Resonanz-Rayleigh-Streuungssensor für den Nachweis von Quecksilber(II)-Ionen genutzt26,27,28. Die katalytische Aktivität dieser Nanomaterialien hängt von ihrer Größe ab, was als „Größeneffekt“ bekannt ist; Beispielsweise kann die große katalytische Aktivität für Goldnanopartikel bei Nanogrößen von weniger als 5,0 nm beobachtet werden 16,29,30. Aus diesem Grund wurden große Anstrengungen unternommen, um die Größe der synthetisierten Nanopartikel zu reduzieren31.

Die berichteten Studien belegen, dass die Verwendung von Polyvinylpyrrolidon-Tensid zur Herstellung von Ag-NPs winzige Nanogrößen unter 10 nm erzeugt und die gebildeten Nanopartikel über einen langen Zeitraum stabilisiert32,33. Darüber hinaus bewirkt die Mikrowellenbestrahlungsenergie im Vergleich zur herkömmlichen Erwärmung eine gleichmäßige und schnelle Erwärmung der Lösung. Dadurch entstehen in der Lösung und unter den Wachstumsbedingungen homogene Keimbildungsstellen, die in kurzer Zeit zu monodispersen Nanopartikeln führen34. Darüber hinaus können durch Mikrowellenbestrahlung eine gute Partikelgrößenverteilung und kleinere Partikelgrößen zur Synthese von Silbernanopartikeln erzielt werden35.

Das Fluoreszenzspektrometer ist eine hochempfindliche Analysetechnik, die in der Regel eine hohe Selektivität ohne Präzisionsverlust bietet36,37,38. Die Entwicklung eines Fluoreszenzsensors zur Detektion von Quecksilber(II)-Ionen, der auf der Peroxidase-ähnlichen Eigenschaft von Silbernanopartikeln basiert, wurde noch nicht untersucht. Daher zielt diese Arbeit darauf ab, die katalytische Aktivität der kleineren Polyvinylpyrrolidon-stabilisierten Silbernanopartikel als Nanozym für die Fluoreszenzdetektion von Quecksilber(II)-Ionen zu nutzen.

O-Phenylendiamin, Polyvinylpyrrolidon und Silbernitrat wurden von Sigma-Aldrich Chemical Co (Steinheim, Deutschland) hergestellt.

Aluminiumnitrat, Bariumchlorid, Cadmiumchlorid, Chromchlorid, Kobaltnitrat, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Wasserstoffperoxid, Quecksilberchlorid, Nickelnitrat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Zinknitrat wurden von El-Nasr Chemical Co. hergestellt ( Kairo, Ägypten). Trinatriumcitrat wurde von Fisher Scientific Co. (Leicestershire, UK) hergestellt. In allen Versuchsschritten wurde Reinstwasser verwendet.

Die Fluoreszenzspektren wurden mit einem FS2-Fluoreszenzspektrometer (Scinco, Korea) durchgeführt. Die Morphologie der vorbereiteten Silbernanopartikel wurde mit JSM 5400 LV SEM (JEOL, Tokio, Japan) charakterisiert. Die Nanogröße, der Polydispersionsindex und die Qualität der hergestellten Silbernanopartikel wurden von ZEN 1690 (Malvern Instruments, Malvern, UK) charakterisiert. Für den Heizprozess wurde der Mikrowellenherd SM-2000MW (Smart Co., China) verwendet.

0,2 % w/v PVP-Lösung, 10 mM Trinatriumcitratlösung und 10 mM Silbernitratlösung wurden gleichzeitig in einen 250-ml-Kolben im Verhältnis 0,5:1:1 gegossen und durch magnetisches Rühren 3 Minuten lang gemischt. Der Kolben wurde durch Mikrowellenbestrahlung etwa 12 Minuten lang auf 90 °C erhitzt. Die Bildung von Polyvinylpyrrolidon-Silber-Nanopartikeln (PVP-AgNPs) kann durch die Umwandlung der farblosen Lösung in einen gelblich-grünen kolloidalen Zustand nachgewiesen werden.

In eine Reihe kalibrierter Kolben (10 ml) wurden geeignete Volumina an Quecksilber(II)-Lösungen (im Bereich von 100 nM bis 20 µM) und 800 µL PVP-AgNPs-Lösung gegossen, 2 Minuten lang inkubiert und anschließend zugegeben von 800 µL einer O-Phenylendiamin-Lösung (hergestellt durch Auflösen von 0,108 g in 100 ml Wasser). Anschließend wurden dem Inhalt 400 µL einer 3 %igen w/v Wasserstoffperoxidlösung zugesetzt und der Inhalt 1 Minute lang gevortext. Nach 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Volumen mit entionisiertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Blindlösung wurde gleichzeitig durch die gleichen Schritte hergestellt, wobei die Zugabe von Quecksilber(II)-Lösung weggelassen wurde. Die Löschung der Fluoreszenzintensität der Blindlösung bei Zugabe von Quecksilber (II) wurde bei der \({\lambda }_{Emission}\) von 563 nm bei der \({\lambda }_{Anregung}\ gemessen. ) von 420 nm. Die Spezifität der vorgeschlagenen Methode wurde durch die Zugabe verschiedener Metallionenlösungen in einer Konzentration von 10 µM anstelle von Quecksilber(II)-Ionen in den oben genannten Verfahren überprüft.

Leitungswasser- und Flaschenwasserproben wurden in unserem Labor und einer örtlichen Einrichtung gesammelt. Die gesammelten Proben wurden mit verschiedenen bekannten Konzentrationen von Quecksilber (II) versetzt. Anschließend wurden die Wasserproben mit einem 0,45-μm-Spritzenfilter gefiltert, um etwaige Partikel zu entfernen. Abschließend wurde der oben erwähnte allgemeine analytische Test durchgeführt.

Die Morphologie und Elementareigenschaften [Partikelgröße, Polydispersitätsindex (PDI), einheitliche Größe] von PVP-AgNPs wurden mit einem SEM-Gerät bzw. einem Zeta-Sizer-Gerät untersucht. Abbildung 1 zeigt das REM-Bild von PVP-AgNPs, das sich auf die kugelstabartige Form des synthetisierten Nanomaterials bezieht. Die gemessene Größe der synthetisierten PVP-AgNPs betrug 5,5 nm mit einheitlicher Größe, guter Qualität und einem niedrigen Polydispersitätsindexwert von 0,440 Abb. 1A. Die Größe von Nanopartikeln ist der Hauptfaktor für ihre katalytische Aktivität39. Im Allgemeinen ist die katalytische Leistung der Silbernanopartikel umgekehrt proportional zur Nanogröße ihrer Partikel40. In der aktuellen Studie ist die ermittelte Größe der hergestellten PVP-AgNPs sehr klein (5,5 nm), was auf ihre überlegene katalytische Aktivität hinweist.

(A) Charakterisierungsgröße, PdI-Wert und Qualität der synthetisierten PVP-Ag-NPs durch Zeta-Sizer-Gerät; (B) Charakterisierung der Morphologie der synthetisierten PVP-Ag-NPs mittels SEM-Gerät.

O-Phenylendiamin (OPD) ist eines der typischen Substrate, die zur Untersuchung der Peroxidase-ähnlichen Aktivität der Nanopartikel25,41 verwendet werden. OPD (farblos und nicht fluoreszierend) wurde durch die Peroxidase-nachahmende Aktivität bestimmter Nanopartikel zu 2,3-Phenazindiamin (farbig und fluoreszierend) oxidiert25. Hierin wurde die Peroxidase-nachahmende Aktivität der hergestellten PVP-AgNPs mit der Fluoreszenztechnik und der spektrophotometrischen Technik unter Verwendung des OPD/H2O2-Systems untersucht. Praktisch wurde die katalytische Aktivität der hergestellten PVP-AgNPs spektrophotometrisch durch das Auftreten eines charakteristischen Absorptionspeaks bei λmax = 420 nm bestätigt, Abb. 2. Darüber hinaus wurde sie fluormetrisch durch das Vorhandensein eines deutlichen Fluoreszenzpeaks bei λemission = nachgewiesen 563 bei λ-Anregung = 420, Abb. 2. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass nur die Mischung aus PVP-AgNPs/OPD/H2O2 dieses Fluoreszenzverhalten aufwies. Im Gegensatz dazu hat keines der PVP-AgNPs/OPD-Mischungen, OPD/H2O2-Mischungen und PVP-AgNPs/H2O2-Mischungen unter den gleichen Bedingungen irgendeinen Fluoreszenzcharakter erzeugt. Diese Absorptionsspitzenwerte und Fluoreszenzemissionsspitzenwerte stimmen mit denen von 2,3-Phenazindiamin überein, über die in Literaturstudien berichtet wurde25.

Untersuchung der Peroxidase-nachahmenden Aktivität für die hergestellten PVP-Ag-NPs durch Bildung der charakterisierten Absorptions- und Fluoreszenzspektren (Anregung/Emission) des OPDA-Reaktionsprodukts (2,3-Phenazindiamin).

Es ist bekannt, dass das farbige 2,3-Phenazindiamin, das ein ausgeprägtes Fluoreszenzverhalten bei λ-Emission = 563 nm/λ-Anregung = 420 nm aufweist, das oxidierte Produkt von o-Phenylendiamin ist. Zunächst veränderte sich die farblose Lösung von nicht fluoreszierend zu einer hell fluoreszierenden gelben Lösung, als die PVP-AgNPs dem o-Phenylendiamin/H2O2-System zugesetzt wurden. Bei dieser Reaktion besaßen die hergestellten PVP-AgNPs eine Peroxidase-nachahmende Aktivität, die die Oxidation von o-Phenylendiamin mit H2O2 katalysieren kann, um 2,3-Phenazindiamin als Hauptreaktionsprodukt zu ergeben.

Quecksilber hat einen einzigartigen Vorteil gegenüber den übrigen Elementen durch seine Fähigkeit, mit bestimmten Elementen wie Gold, Platin und Silber ein Amalgam zu bilden24,25,27,28,42,43. Daher führt in dieser Studie die Bildung von Ag-Hg-Amalgam zu einer wirksamen Hemmung der katalytischen Aktivität von PVP-AgNPs, verbunden mit einer Veränderung ihrer Oberflächeneigenschaften. Diese katalytische Hemmwirkung von PVP-AgNPs verhindert die Umwandlung des OPD/H2O2-Systems in 2,3-Phenazindiamin. Dementsprechend ergibt sich eine Löschwirkung auf die Fluoreszenzintensität der Lösung bei Zugabe von Quecksilber (II) im Vergleich zur Fluoreszenzintensität der Blindprobe (ohne Hg2+), Abb. 3. Daher ist die selektive Bestimmung von Quecksilber (II) in a Es wurde ein bestimmter linearer Konzentrationsbereich erreicht. Der Erfassungsmechanismus von Quecksilber (II) ist in Schema 1 dargestellt.

(A) für Fluoreszenzspektren (Anregung und Emission) des Systems OPD/H2O2/PVP-Ag-NPs (a, b) und nach deren Löschung durch 1,0 µM Hg2+ (c, d), während (B) für Fluoreszenz Spektren des OPD/H2O2/PVP-Ag-NPs-Systems in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Hg2+.

Schematische Erläuterung zum Nachweis von Quecksilber (II) mittels spektrofluorimetrischer Technik.

Die Reaktionsbedingungen umfassten das Volumen von H2O2, die Reaktionszeit, das Volumen von OPDA und das Volumen von PVP-Ag-NPs, die untersucht und optimiert wurden, um die optimalen Bedingungen für die Analyse zu finden. Das Sensorsystem wurde 15 Minuten lang mit Quecksilber (II) inkubiert und die optimalen Bedingungen für die Löschung der Fluoreszenzintensität der Lösung (im Vergleich zur Blindlösung) wurden mit 800 µL PVP-AgNPs-Suspension und 800 µL OPD erreicht Lösung und 400 µL 3 % w/v Wasserstoffperoxidlösung, Abb. 4. Dieser Löscheffekt in der Fluoreszenzintensität der Lösung ist direkt proportional zur Konzentration von Quecksilber (II).

Untersuchung des Reagenzienvolumens für den Nachweis von Hg2+ (1,0 µM) mit der vorgeschlagenen Methode.

Die lineare Beziehung zwischen der Löschung der Fluoreszenzemission bei 563 nm und der Quecksilber(II)-Konzentration wurde im Bereich von 20 nM bis 2 μM mit der Regressionsgleichung \(y=0,1352x +13,51\), einem R2-Wert von 0,998, ermittelt. und LOD-Wert von 8,9 nM (S/N = 3, wobei N für Rauschen und S für Empfindlichkeit steht). Die statistischen Parameter für den Nachweis von Hg2+ mit der Fluoreszenzmethode sind in Tabelle 1 dargestellt. Andere übliche Metalle wie Al3+, Ba2+, Ca2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, K+, Mg2+, Ni2+, Na+ und Zn2+ wurden mit der aktuellen Fluoreszenz getestet Methodik zur Untersuchung der Selektivität des Design-Sensing-Systems. Es wurde festgestellt, dass bei der Zugabe von Metallen aus den genannten Metallen in höheren Konzentrationen (zehnfacher Überschuss im Vergleich zu Quecksilber (II)) keine offensichtliche Auswirkung auf die Emissionsintensität des PVP-AgNPs/OPD/H2O2-Systems festgestellt wurde. Im Gegensatz dazu wurde die Emissionsintensität von PVP-AgNPs/OPD/H2O2 in Gegenwart von Quecksilber (II) deutlich verringert, was auf die gute Selektivität für das hergestellte System hinweist (Abb. 5). Die Erklärung für die perfekte Selektivität der vorgeschlagenen Methode für Quecksilber (II) kann auf die Bildung von Ag-Hg-Amalgam durch eine spezifische Wechselwirkung zwischen Silbernanopartikeln und Quecksilber(II)-Ionen zurückgeführt werden42.

Untersuchung der Selektivität des verwendeten Systems (OPD + H2O2 + PVP-Ag-NPs) für den Nachweis von Hg2+-Ionen (1 µM) in Gegenwart von Ionen unedler Metalle (10 µM).

Die Anwendungen von PVP-AgNPs für Experimente mit dotierten Proben wurden mit Leitungswasserproben und Flaschenwasserproben durchgeführt. Um die Praktikabilität der Anwendung der Fluoreszenzmethode in Leitungswasserproben und Flaschenwasserproben zu bewerten, wurden diese mit Quecksilber (II) in unterschiedlichen Konzentrationen versetzt und mit der vorgeschlagenen Methode getestet. Die Daten in Tabelle 2 beziehen sich auf die guten Wiederfindungs- und SD-Werte zur Bestimmung von Quecksilber(II)-Ionen mit der aktuellen Methode. Diese SD- und Wiederfindungswerte belegen die Gültigkeit der Genauigkeit und Präzision der vorgestellten Methode zum Nachweis von Quecksilber (II) in Leitungswasserproben und Flaschenwasserproben.

In dieser Studie wurde die Mikrowellenbestrahlungsenergie genutzt, um die Synthese von Polyvinylpyrrolidon-stabilisierten Silbernanopartikeln mit sehr kleinen Nanogrößen zu unterstützen. Die hergestellten Silbernanopartikel zeigten ein ausgeprägtes Peroxidase-Aktivitätsverhalten. Basierend auf der Hemmwirkung von Quecksilber(II)-Ionen auf diese Peroxidaseaktivität der hergestellten Silbernanopartikel wurde eine Fluoreszenzmethode mit einer hochempfindlichen und äußerst selektiven Reaktion auf den Nachweis von Quecksilber(II)-Ionen entwickelt. Unter optimalen Bedingungen wies der bereitgestellte Assay eine Nachweisgrenze (LOD) von 8,9 nM mit einem linearen Bereich von 20–2000 nM auf. Die aktuelle Methodik bot einige Vorteile hinsichtlich der Grünheit der Synthese, der winzigen Partikelgröße, der guten Stabilität und Gleichmäßigkeit, der Verwendung einer geringeren Konzentration des Nanozyms und der einfachen Detektion.

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Abteilung für pharmazeutische analytische Chemie, Fakultät für Pharmazie, Al-Azhar-Universität, Zweigstelle Assiut, Assiut, 71524, Ägypten

Mohamed A. Abdel-Lateef

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Das Manuskript wurde von MA-L erstellt.

Korrespondenz mit Mohamed A. Abdel-Lateef.

Der Autor gibt keine Interessenkonflikte an.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Abdel-Lateef, MA Nutzung der Peroxidase-ähnlichen Aktivität von Silbernanopartikeln Nanozym auf dem O-Phenylendiamin/H2O2-System zur Fluoreszenzdetektion von Quecksilber(II)-Ionen. Sci Rep 12, 6953 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-10779-8

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Eingegangen: 18. Januar 2022

Angenommen: 11. April 2022

Veröffentlicht: 28. April 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-10779-8

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Chemische Papiere (2023)

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